隐球菌病实验室诊断方法的研究进展总结2026

隐球菌病实验室诊断方法的研究进展总结2026隐球菌病是由隐球菌属真菌（新型隐球菌和格特隐球菌）引发的机会性感染真菌病，其侵袭性与宿主免疫状态相关，易感于艾滋病患者、器官移植受者和癌症患者。隐球菌经呼吸道进入宿主体内，可感染肺、皮肤、眼睛、骨骼和脑等多个器官，引起致命性的肺炎和脑膜炎。目前，隐球菌病传统实验室诊断方法包括直接镜检、培养、抗原检测、分子生物学方法等。近年来，一些新开发的检测技术在隐球菌病诊断方面表现良好。如表面增强拉曼散射法、夹心化学发光磁性微粒免疫测定法、微滴式数字PCR、纳米孔靶向测序、基于聚集规则间隔短回文重复-Cas12a技术的快速检测法和电微流控生物芯片法等，表现为成本低廉、检测时间短、特异性和敏感性更高。本文综述了隐球菌病实验室诊断方法的研究进展，比较其优点与局限性并探讨未来隐球菌病诊断发展方向。隐球菌病是主要由新型隐球菌和格特隐球菌感染所引起的机会性人畜共患真菌病，治疗困难且死亡率高。全球每年新增感染病例约19万，死亡病例达14.7万

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1］

。2022年，世界卫生组织将新型隐球菌列为首要真菌病原体

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2］

。环境中干燥酵母细胞或担孢子形态的隐球菌经呼吸道侵入人体后，引发隐球菌性肺炎（pulmonarycryptococcosis，PC），进而通过血液传播至全身，导致皮肤、眼睛和骨骼等多器官感染，最终侵入中枢神经系统，引发致命性脑膜炎（cryptococcalmeningitis，CM）

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3,4］

。隐球菌病患者临床表现复杂隐匿，缺乏特异性，与细菌性肺炎、肺结核、病毒性脑膜炎和结核性脑膜炎等疾病症状类似，早期诊断难度较大

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5,6］

。尤其在免疫正常患者感染增多、高毒力株出现和耐药性显现的背景下，快速精准的诊断方法是降低隐球菌病死亡率的关键。一、隐球菌病实验室常规诊断方法根据2024年隐球菌病诊断和管理全球指南建议

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，所有疑似或确诊为隐球菌病（包括隐球菌抗原血症）的患者，均需进行中枢神经系统、肺部及其他可能受累身体部位的临床检查。目前，隐球菌病实验室诊断方法主要包括直接镜检、培养、隐球菌抗原检测（cryptococcalantigen，CrAg）、分子生物学技术等。根据2023年侵袭性真菌病真菌学检查指南

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，临床上常需结合患者临床特征结合多种检测方法以提高诊断准确性和可靠性。（一）直接镜检1.墨汁染色法：隐球菌因有肥厚荚膜不被墨汁染色，将患者样本（脑脊液、血液或支气管肺泡灌洗液等）经墨汁染色后在显微镜下可见透明荚膜和孢子。操作简单快速、成本低，但敏感性有限，依赖样本中真菌负荷量。2.黏蛋白卡红染色法：卡红是一种阳离子染料，能够与隐球菌荚膜带负电荷的酸性黏多糖基团特异结合，进而将隐球菌荚膜染成玫瑰红色或深红色，尤其适用于石蜡包埋的组织切片（如肺组织、脑组织等活检标本）。该方法具有高特异性，但受组织载菌量和隐球菌荚膜厚度影响，敏感度较低，操作繁琐、耗时较长，结果依赖于经验丰富的病理或检验人员判读。3.其他染色法：取患者感染部位组织标本（肺或脑组织），经苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色、过碘酸希夫（periodicacidschiff，PAS）染色或六亚甲基四胺银（gomori′smethenaminesilver，GMS）染色后在显微镜下观察。Wang等

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9］

使用GMS染色、PAS染色和阿利新蓝（alcianblue，AB）染色法诊断PC，发现GMS染色检出率为100.0%（152/152），高于PAS染色94.7%（144/152）和阿利AB染色81.6%（124/152），并且GMS染色法的隐球菌孢子突出，背景干净，识别性更强。（二）真菌培养培养是隐球菌鉴定的金标准，将患者标本前处理后，接种于沙氏葡萄糖琼脂（sabourauddextroseagar，SDA）、脑心浸膏琼脂（brainheartinfusionagar，BHI）、抑制性霉菌琼脂（inhibitorymoldagar，IMA）或咖啡酸等培养基上培养鉴定，操作简单，敏感度和特异度高，但耗时长不适于快速鉴定。（三）CrAg隐球菌抗原检测包括乳胶凝集试验法（latexagglutinationtest，LA）、侧流免疫层析试纸条法（lateral-flowimmunochromatographicassay，LFA）和酶联免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）。由于隐球菌荚膜多糖抗原可与抗体特异性结合，再通过凝集反应、侧向层析或化学发光等方式放大信号进行检测

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。有研究报道，CrAg-LFA法可作为HIV阴性人群隐球菌病的快速诊断工具，且无需依赖滴度测定

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。隐球菌抗原检测法常用于诊断隐球菌病，适用于血清和脑脊液样本，并且其对脑脊液样本的检测敏感度和特异度可达95%以上

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。但隐球菌抗原检测法存在准确性缺陷（假阴/阳性）、样本局限性（非脑脊液样本诊断效能有限）和技术操作短板（需要酶标仪）。Hu等

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和Zhu等

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发现，在47例PC患者样本中，肺穿刺液与血清的CrAg-LFA检测特异度一致（100%），但敏感度更高（97.9%和76.6%）；在33例PC患者样本中，支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF）CrAg-LFA的敏感度（93.9%）和特异度（100%）均高于血清CrAg-LFA检测（72.7%和98.7%），这表明肺穿刺液和BALF的CrAg-LFA检测对于PC患者具有重要诊断价值，或能解决隐球菌抗原检测法的样本局限性问题。（四）分子生物学方法1.PCR技术：设计隐球菌特异靶基因引物，通过PCR扩增或将侧向流动层析试纸条（lateralflowstrip，LFS）与重组酶聚合酶扩增（recombinasepolymeraseamplification，RPA）技术结合，检测临床样本中的DNA，可提高诊断特异度和敏感度，并降低检测成本和时间。有研究报道，在25份临床样本中，针对隐球菌荚膜相关基因（capsuleassociatedprotein10，CAP10）设计的引物最低检测限10CFU/ml，特异度92%，敏感度95%，在检测血液样本和肺隐球菌病诊断方面具有重要意义

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15］

。Wang等

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开发的基于RPA结合胶体金试纸条（RPA-LFS）扩增隐球菌荚膜基因（capsuleassociatedprotein64，CAP64），可完全检测出90份临床阳性脑脊液样本，检测限10CFU/μl，20min内获得结果，特异度和敏感度高。Tay等

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17］

开发的基于隐球菌细胞色素B基因（cytochromeb，cytb）实时PCR检测法在25个新鲜冷冻石蜡包埋标本（formalin-fixedandparaffin-embedding，FFPE）提取DNA中检测敏感度（96.4%）优于全真菌PCR（76.9%）和培养（14.5%），特异度100%。2.测序技术：测序技术在隐球菌病诊断中具有显著优势，在精准性、敏感度、分型能力等方面优于传统诊断方法。宏基因组二代测序（metagenomicnext-generationsequencing，mNGS）具有高通量和广谱检测的优点，已被广泛用于临床感染性疾病诊断

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18,19,20］

。然而，有研究发现mNGS诊断CM敏感度（92%）低于CrAg检测（96.7%），但高于墨汁染色（79.5%）和培养（63.4%）

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21］

。Huang等

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22］

发现，将mNGS与CrAg联合使用可提高PC患者诊断敏感度达14/15。Jin等

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23］

通过对比纳米孔测序与NGS在CM患者脑脊液DNA检测中的表现，发现纳米孔测序读长更长，且能解析重复序列和结构变异区域，这对CM临床诊断具有重要价值。Dantas等

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24］

评估了5.8S（ribosomalDNAinternaltranscribedspacer，rDNAITS）序列特异性巢式PCR法，检测了疑似CM患者的血清和脑脊液，具有高敏感度（89%~100%）和高特异度（100%）。此外，Mbangiwa等

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25］

建立了基于隐球菌肽类群感效应分子（quorumsensingpeptide1，QSP1）和多拷贝28SrRNA基因的qPCR检测法，在脑脊液中检测敏感度为98.2%和91.4%。二、隐球菌病实验室诊断新方法（一）表面增强拉曼散射（surfaceenhancementoframanscattering，SERS）技术SERS技术以其高敏感度、快速响应性和高特异性在疾病诊断中显示出广阔应用前景

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26,27］

。Jiang等

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28］

建立了基于SERS技术的隐球菌葡萄糖醛酸木聚糖（glucuronoxylomannan，GXM）检测法。当磁性SERS底物（抗体连接Fe3O4@AuNP磁珠）、GXM和SERS标签形成底物夹心复合物时，它们之间的局部耦合表面等离子体发生共振效应而产生增强的拉曼信号，有助于隐球菌GXM检测。结果显示，空白样品中拉曼信号强度远低于GXM样品（10

5

ng/ml），在PBS+GXM样品中，拉曼信号强度与GXM浓度具有良好的正相关线性关系（

R

2为0.994），并具有10~10

5

ng/ml的较宽线性范围；在正常人血清+GXM样品中，即使在高浓度（100μg/ml）葡萄糖、尿素、血清白蛋白和免疫球蛋白G等常见血清成分的干扰下，其拉曼信号强度仍比1μg/mlGXM低一个数量级；在加标血清实验中，该技术成功检测并区分了GXM浓度低至1.25ng/ml的样本，且能明确区分隐球菌病感染阴性（<2.5ng/ml）、阳性（≥2.5ng/ml）及强阳性（≥25ng/ml）状态，证明了其巨大的临床诊断潜力。但SERS对于临床样本的检测能力未知，且不能鉴定是何种隐球菌感染。（二）夹心化学发光法相比于传统的LA、LFA和ELISA隐球菌抗原检测法，化学发光分析法具有低成本和快速反应的特点。最近，Li等

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29］

开发出了夹心化学发光磁性微粒免疫测定法（chemiluminescentmicro-particleimmunoassay，CMIA）。CMIA是由捕获抗体、生物素化抗体（识别元件）和Streptavidin-polyHRP（信号成分）修饰的磁珠，可在22min内检测患者血清中的CrAg，检测线性范围较宽（2~10000ng/ml），灵敏度高（0.24ng/ml），且与其他病原体无交叉反应。而且在55例确诊隐球菌感染患者及72例无侵袭性真菌病（invasivefungaldisease，IFD）证据的对照者队列中，CMIA法与商业化ELISA试剂盒的总体定性一致率为92.91%（95%

CI

80.97%~93.02%）。此外，Yu等

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30］

开发了基于磁颗粒化学发光和双抗体夹心免疫反应的新型化学发光法并与传统的胶体金法进行对比，发现在47例PC患者和8例CM患者的血清和脑脊液中，该方法的敏感度和特异度（98.2%和100%）均高于胶体金法（96.4%和98.8%），但2种方法的受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic，ROC）为0.996和0.976，差异无统计学意义（

P=0.086）。总的来说，化学发光法不仅减少了由不适当的抗原/抗体比例和交叉反应引起的假阴/阳性结果，并且还能动态检测CrAg滴度的变化，其对于隐球菌病临床诊断具有重要意义。（三）纳米孔靶向测序（nanopore-targetedsequencing，NTS）平台早期准确病因诊断对改善人类免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）患者中枢神经系统（centralnervoussystem，CNS）感染预后非常重要，并且CM是HIV患者中常见的机会性中枢神经系统感染疾病，但这一目标很难通过传统检测方法实现。Yang等

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31］

开发了NTS平台，并评估了HIV患者CNS感染的诊断性能，特别关注于CM感染。在纳米孔测序之前，使用靶特异性PCR扩增富集病原体序列，然后对储存的脑脊液样本进行NTS，并将结果与住院期间的诊断进行比较。结果显示，在27例CM患者脑脊液样本中，NTS平台的敏感度为85.2%，高于脑脊液培养70.4%（95%

CI

51.5%~84.1%）、印度墨汁染色76.0%（95%

CI

56.6%~88.5%）、PCR敏感度77.8%（95%

CI

59.2%~89.4%），所有方法特异度均为100%。此外，NTS能够检测HIV感染患者脑脊液样本中常见的中枢神经系统病原体感染，包括弓形虫脑炎（toxoplasmicencephalopathy，TE）、巨细胞病毒脑炎（Cytomegalovirusencephalitis，CMV）和水痘带状疱疹病毒脑炎（Varicella-Zostervirusencephalitis，VZV）等。由于NTS比宏基因组测序需要更少的数据，这将大大节省测试成本，其有望成为新的诊断HIV感染患者中CM的方法。（四）微滴式数字PCR（dropletdigitalPCR，ddPCR）和巨磁阻技术（giantmagnetoresistance，GMR）样本中游离DNA（cell-freeDNA，cfDNA）检测在真菌感染诊断中具有突破性意义，尤其适用于传统方法（如培养、抗原检测）受限的复杂临床场景。ddPCR是一种基于液滴平衡的核酸分子绝对定量技术，仅需少量样品，可实现快速灵敏检测，步骤包括样本中核酸提取、混合反应液、液滴生成、PCR扩增和数据分析。Guo等

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32］

利用ddPCR检测了170份肺部感染真菌（耶氏肺孢子菌、曲霉菌和隐球菌）的肺泡灌洗液样本的DNA，结果显示隐球菌属的ROC为0.998（95%

CI

0.955~0.993，

P<0.01），敏感度100%，特异度97.9%。此外，Vergidis等

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33］

开发的基于GMR，是检测样本中微量cfDNA的多重PCR诊断方法，当单链DNA流过GMR传感器（含有不同真菌探针）时，经杂交后可检测到GMR信号。在加标血清样本中可检测到包括新型隐球菌和格特隐球菌在内的18种侵袭性真菌感染，检出限为5~50拷贝/次，但或许由于检测样本数量过少和样本中cfDNA含量极低，GMR并未在2例血培养为阴性的隐球菌病患者的脑脊液和肺泡灌洗液中检测到cfDNA。这表明临床样本中的cfDNA检测在隐球菌病早期诊断方面可能具有一定价值，但后续需要大量临床样本加以验证。（五）基因编辑技术传统分子诊断技术具有理论高敏感度与特异性、不受免疫干扰和多样本类型适用的优点，但存在实际敏感度波动大、气溶胶污染和定量能力有限等不足。一些新开发的基因编辑技术或能解决这些局限性问题。Liu等

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34］

将RPA和聚集规则间隔短回文重复（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR）技术结合，开发了基于CRISPR-Cas12a技术的快速、灵敏、特异的CM检测法。该方法可在50min内完成，包括DNA提取、RPA反应和CRISPR检测，最终在实时荧光PCR仪和LFS免疫层析试纸条上进行检测，并且引入的CRISPR-Cas12a减少了气溶胶污染，最大限度地减少了假阴/阳性。在36份临床样本中的检测限为100拷贝/μl，特异度和敏感度100%，可实现新型/格特隐球菌物种鉴定。但该方法不能鉴定死菌活菌，而且临床样本数量较少。此外，Ye等

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开发的基于快速双重活瓣探针的等温检测法，将等温扩增和高特异性荧光探针结合，然后在SLAN-96PPCR系统中检测荧光信号，可在1h内完成新型/格特隐球菌的鉴定。在加标临床分离菌株的30份脑脊液和30份支气管肺泡灌洗液样本中，灵敏度10拷贝/μl，特异度100%。但其局限性在于加标样本与临床样本检测结果可能存在误差，并且样本数量略有不足。Kong等

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开发的电微流控生物芯片，包括电穿孔裂解区和电化学检测区，集高敏感度、快速电化学检测、隐球菌快速裂解、核酸提取于一身。结果显示，在20份临床样本中，与传统的隐球菌基因组提取方法相比，该方法可在20min内完成检测并区分亚型，对于新型和格特隐球菌的检测限为60和100pg/ml。这表明基因编辑技术既可实现隐球菌的快速检测并且能区分隐球菌亚型，特异性和敏感度高，其在隐球菌病诊断和预防中具有广阔潜力。（六）人工智能模型隐球菌诊断的金标准是镜检和培养，但需要特殊类型的设备和临床专业知识。近年来，人工智能模型在隐球菌病诊断领域发挥重要作用。Seyer等

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使用VGG16深度学习检测模型来训练、验证、测试和评估，可辅助检测经印度墨汁染色脑脊液涂片显微图像中的隐球菌，准确率和损失值分别为86.88%和0.362，但仍需要大量数据和图像库进行模型训练。Bermejo-Peláez等

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检测了范围为0~5000ng/ml的53种隐球菌抗原浓度，制备了318条隐球菌抗原半定量（cryptococcalantigensemi-quantitative，CrAgSQ）LFA试纸条并获得了一个1272张图像的数据集，开发了一种专为CrAgSQLFA自动化判读而设计的AI算法，较人眼判读显示出更少判读差异（

P< 0.001），且基于LFA照片即可预测CrA