CN113574174B 用于增强的淋巴细胞介导的免疫治疗的组合物和方法 （省卫生服务局）

2021.08.11PCT/CA2020/0501852020.02.12WO2020/163953EN2020.08.20用于增强的淋巴细胞介导的免疫治疗的组公开了可用于免疫治疗的具有被抑制的自体，例如嵌合抗原受体(CAR)或者内源性或经改造T细胞受体，以靶向表达肿瘤特异性抗原的细一些这样的淋巴细胞可用于进行CAR-T或TCR23入所述自噬相关(ATG)基因的基因座内以破坏所述自噬相关(ATG)基3.根据权利要求2所述的淋巴细胞，其中编码所述抗原靶向受体的核酸插入所述自噬基因的基因座内，以使得所述抗原靶向受体的表达由所述自噬相关(ATG)基因的内源性启4.根据权利要求1至3中任一项所述的淋巴细胞，其中编码所述5.根据权利要求1至3中任一项所述的淋巴细胞，6.根据权利要求5所述的淋巴细胞，其中所述自噬相关(抗原靶向受体的核酸插入所述ATG5基因的7.根据权利要求6所述的淋巴细胞，其中用于插入所述抗原靶向受体的核酸具有SEQ8.根据权利要求1所述的淋巴细胞，其中所述自噬相10.用于免疫治疗的淋巴细胞，其包含抗原靶向受体和被消除的自噬相关(ATG)基因，11.根据权利要求1至10中任一项所述的淋巴细胞在制备用于治疗乳腺癌、前列腺癌、12.根据权利要求11所述的用途，其中所述淋巴细胞用于制备用于治疗表达α-叶酸受13.制备用于免疫治疗的淋巴细胞的方法，所述方法包括修饰所述淋巴细胞以消除自因的步骤和修饰所述淋巴细胞以表达所述抗原靶向受体的步骤之一或二者使用基因编辑17.根据权利要求14所述的方法，其中所述基因编辑方法用于插入编码所述抗原靶向受体的核酸，以使得所述抗原靶向受体的表达由所述自噬相关(ATG)基因的内源性启动子418.根据权利要求16所述的方法，其中所述基因编辑方法用于将编码所述抗原靶向受体的所述核酸插入所述自噬相关(ATG)19.根据权利要求18所述的方法，其中所述自噬基因是ATG5并且将编码所述抗原靶向20.根据权利要求19所述的方法，其中用于插入所述抗原靶向受体的核酸构建体包含行所述CRISPR-Cas基因编辑的sgRNA包含SEQIDNO:1至22.根据权利要求13所述的方法，其中修饰所述淋巴细胞以表达所述抗原靶向受体的23.根据权利要求22所述的方法，其中修饰所述淋步骤包括在所述基因组的第二基因座处敲除所述自噬相关(ATG)基因，所述第二基因座与24.根据权利要求22所述的方法，其中修饰所述淋巴细胞以表达所述抗原靶向受体的步骤包括插入编码异源启动子的核酸以驱动25.根据权利要求13所述的方法，其中27.根据权利要求26所述的方法，其中敲除所述28.根据权利要求13所述的方法，其中所述修饰所述淋巴细胞以消除所述自噬相关29.由权利要求13所述的方法制备的淋巴细胞在制备用于进行用于治疗乳腺癌、前列30.根据权利要求29所述的用途，其中所述淋巴细胞包含具有杀伤肿瘤细胞活性的淋32.根据权利要求1至8中任一项所述的淋巴细胞，其中所述自噬相关(ATG)基因是33.根据权利要求1至8中任一项所述的淋巴细胞，其中所述自噬相关(ATG)基因是34.根据权利要求13至25或28中任一项所述的方法，其中所述自噬相关(ATG)基因是35.根据权利要求13至25或28中任一项所述的淋巴36.根据权利要求1至10中任一项所述的537.根据权利要求1至10中任一项所述的淋巴38.根据权利要求37所述的淋巴细胞，其中所述肿瘤特异性抗原包括叶酸受体(FR)、40.根据权利要求37所述的淋巴细胞，其中所述抗原靶向受体包含嵌合抗原受体41.根据权利要求1至10中任一项所述的淋巴细胞，其42.根据权利要求41所述的淋巴细胞，其中用于在所述淋核苷酸构建体具有SEQIDNO:8或SEQIDNO:9中任一者的核酸序列。6[0002]本申请要求于2019年2月12日提交的美国临时专利申请No.62/804658的优先权和[0004]本发明部分地是在由美国陆军医学研究与发展部(U.S.ArmyMedicalResearchandDevelopmentCommand)授予的授权号(AwardNumber)W81XWH-18-1-0264下进行的基[0005]本发明的一些实施方案涉及作为免疫治疗剂的具有改善效力的经遗传改造的淋的方法和组合物。一些实施方案涉及用于对嵌合抗原受体T细胞(chimericantigenreceptorT-cell，CAR-T)或者经改造或内源性T细胞受体T细胞(TcellreceptorT-性癌(high-gradeserouscarcinoma，H总体患者存活。然而，有明确的证据表明，肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltrating取中发挥作用。已观察到αFR在卵巢癌、乳腺癌和肺癌中水平高，但在正常组织中水平低7体瘤中已显示出效力有限(6)。解释对于实体瘤缺乏观察到的效力的一种可能性是肿瘤生癌症以高速率使用葡萄糖和谷氨酰胺作为细胞生长和增殖的主要生物合成前体(8)。最近具有高的糖酵解率的肿瘤相比，鼠肿瘤中CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在具有降低的葡萄线粒体质量的损失与1型细胞因子减少、检查点抑制剂表达提高和抗肿瘤活性丧失相关生长因子剥夺激活的存活途径(14)。缺乏自噬基因(例如Atg5或Atg7)的T细胞会损害胸腺宾夕法尼亚大学的小组成功进行了测试在T细胞中多重CRISPR-Cas9编辑的安全性和可行8胞表面上的肿瘤特异性抗原)并发挥杀伤这样的细胞的作用的类似机制[0016]本发明的一些实施方案解决了本领域中对使用淋巴细胞进行免疫治疗(特别是用Cas、锌指核酸酶(zinc-fingernuclease，ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN)、睡美人(Sleeping[0024]在一些方面中，经遗传改造的淋巴细胞表达抗原靶向受体，例如嵌合抗原受体9[0026]在一个方面中，提供了通过抑制嵌合抗原受体(CAR)T细胞(CAR-T)中的自噬来改[0027]在一个方面中，提供了在原代人自体T细胞中的自噬(ATG)基因座处插入CAR核酸一些方面针对敲除或抑制靶向的)T细胞自噬(ATG)基因可以是本领域技术人员已知的任何受体靶向的抗原是肿瘤特异性抗原，其包括但不限于，例如CD19、CD20、BCMA、Her2、EGFRvIII、PSMA(前列腺特异性膜抗原(prostatespecificmembraneantigen))和FR(叶[0030]在一个方面中，使用CRISPR-Cas9基因编辑将经改造CAR-T细胞(其中CAR序列对α整合到ATG5基因座之后αFR-CAR的表达可由内源性基因启动子或使用异源启动子驱动。用于核酸酶和供体递送的方法是本领域技术人员已知的并且可包括核酸或核糖核蛋白[0031]在一个方面中，使用CRISPR-Cas9基因编辑将经改造CAR-T细胞(其中CAR序列对α叶酸受体(αFR)具有特异性)“敲入”T细胞的ATG14基因的基因座。这产生了具有消除的ATG14基因活性/功能的经改造CAR-T细胞(称为αFR-CAR-T)，其对于治疗表达α-FR的癌症[0034]在一个方面中，用于在本发明的多种ATG基因的基因座处产生CAR-T敲入的原代T[0035]在一个方面中，可对多于一种ATG基因座/基因(即两种或更多种不同的ATG基因)[0036]在一个方面中，用于敲入的αFR-CAR序列靶向至ATG5基因座/基因的除内含子2以[0037]通过考虑本发明一些优选实施方案的随后描述，本发明的其他方面将变得明[0040]图2是一个实施方案的示意图，其中已将编码CAR的DNA插入细胞毒性淋巴细胞的[0041]图3是一个实施方案的示意图，其中已将编码CAR的DNA插入细胞毒性淋巴细胞的[0042]图4示出了用于产生用于免疫治疗的经遗传改造的淋巴细胞的方法的一个示例性[0043]图5示出了用于产生用于免疫治疗的经遗传改造的淋巴细胞的方法的另一个示例[0044]图6示出了用于产生用于免疫治疗的经遗传改造的淋巴细胞的方法的另一个示例[0055]图17示出了用于将由慢病毒载体转导的期望的αF随后将ATG5sgRNA电穿孔到ATG5基因的外显子4或外显子5中以敲除ATG5的策略。A栏示出了用于将构建体并入T细胞并敲除ATG5的策略。B栏示出了表明在ATG5外显子4处的成功缺淋巴细胞(包括CAR-T细胞)中消除自噬基因表达以增强细胞(包括针对实体瘤)的治疗效力特异性地靶向α-叶酸受体(αFR)，以改善其治疗表达αFR的癌症(例如卵巢癌、乳腺癌和肺[0058]在一个方面中，本发明人设计了新的CRISPR-Cas9基因编辑策略以改造针对作为示例性肿瘤特异性抗原的卵巢癌抗原叶酸受体α(αFR)的自噬缺陷型淋巴细胞，包括CAR-T(CAR)靶向至示例性自噬基因(自噬相关基因5(ATG5))的基因座中，本发明人破坏了自噬，receptor，TCR)构建体)置于诱导响应于应激的表达的启动子(例如内源性自噬基因启动子)的控制下意味着抗原靶向受体(例如CAR或TCR)的表达水平在身体外周会低，但在肿瘤微环境中会提高。这可潜在地降低与高剂量的表达抗原靶向受体的细胞(例如CAR-T细胞)过继性T细胞治疗实验时，本发明人观察到当与野生型CD8+T细胞相比时对肿瘤的治疗作缚，T细胞中自噬的特异性丧失可对T细胞治疗具有数种益处。已发现来自荷瘤小鼠的件风险的过程。Atg5-/-T细胞的另一特征是在免疫应答基因的特定基因座处组蛋白三甲基化的代谢依赖性变化以及那些靶标的转录表达[0063]被抑制的自噬基因所提供的这样的益处可扩展到其他淋巴细胞和参与肿瘤杀伤通过识别抗原(例如肿瘤细胞表面上的肿瘤特异性抗原)并发挥杀伤这样的肿瘤细胞的作施方案中，可使用任何期望的策略来抑制淋巴细胞(例如CART细胞)中的一种或更多种自(例如慢病毒载体或逆转录病毒载体)转导细胞以将编码CAR或经改造T细胞受体的核苷酸辑技术来破坏自噬基因和/或将抗原靶向受体构建体引入细胞中以进行表达。在一些实施[0065]在一些实施方案中，经改造淋巴细胞(例如CART细胞)表达对肿瘤特异性抗原具些实施方案中，肿瘤特异性抗原是α-叶酸受体(α-FR)，其是在某些种类的癌症(包括卵巢用于治疗某些癌症的一些示例性肿瘤特异性抗原的非详尽列表在表1中给出。在一些实施枢神经系统癌或ROR1-阳性恶性肿瘤。原靶向受体(例如CAR构建体或TCR构建体)在除待抑制自噬基因以外的基因座处插入淋巴体或TCR构建体)与期望的异源启动子一起插入以通过在异源启动子控制下的淋巴细胞(例[0071]在一些实施方案中，淋巴细胞经改造以表达内源性或经改造T细胞受体而不是表体瘤的治疗，并且可以以类似于CAR-T细胞的方式用于特异性地靶向和杀伤表达特定抗原[0072]在一些实施方案中，在淋巴细胞中被抑制的自噬基因(ATG)是现在已知或之后发[0075]用于一些实施方案中的CAR构建体30的一个示例性实施方案在图1中示出。CAR构[0076]图2示意性地示出了经改造淋巴细胞50的一个示例性实施方案。经改造淋巴细胞50已被遗传修饰以在淋巴细胞基因组DNA的基因座52处抑制自噬所必需的一种或更多种基在淋巴细胞基因组DNA的不同于基因座52的基因座54处表达期望的抗原靶向受体构建体。案中可以是内源性启动子或在一些实施方案中可以是异[0077]图3示意性地示出了经改造淋巴细胞70的一个示例性实施方案。经改造淋巴细胞70已被遗传修饰以在淋巴细胞基因组DNA的基因座72处抑制自噬所必需的一种或更多种基DNA的基因座72处破坏自噬所必需的基因以及插入期望的抗原靶向受体构建体二者。在该细胞)可通过本领域技术人员现在已知或之后可用的任何合适的遗传改造技术来制备。在图4中示出的一个示例性实施方案中，示出了使用基因编辑策略在待破坏自噬基因的基因到淋巴细胞基因组DNA中，并抑制至少一种自噬基因的功能。在一些实施方案中，使用[0080]在步骤106中，扩增了其中抗原靶向受体构建体已成功插入正确基因座的经遗传[0081]图5示出了产生用于免疫治疗的经修饰淋巴细胞(例如T细胞)的方法150的一个替[0083]图6示出了产生用于免疫治疗的经修饰淋巴细胞(例如T细胞)的方法170的一个替代实施方案。步骤172和174以与方法150的步骤152和154类似的方式进行以产生经遗传改(例如CAR构建体或经改造T细胞受体)的技术的一些实例包括CRISPR-Cas编辑系统或者用制的自噬基因和表达期望的抗原靶向受体(例如CAR构建体或经改造T细胞受体)二者的淋[0084]在一些实施方案中，经遗传改造的淋巴细胞(例如T细胞)用作免疫治疗剂来治疗[0085]在其中使用CRISPR-Cas策略将抗原靶向受体构建体引入淋巴细胞中以进行表达开发合适的单指导RNA(singleguideRNA，sgRNA)以实现将抗原靶向受体(例如CAR)插入体(例如CAR)插入淋巴细胞基因组中ATG5基因的基因座内。在一些实施方案中，使用CRISPR-Cas策略将抗原靶向受体(例如CAR)插入ATG5基因的内含子2内。在一些实施方案[0087]在一个示例性实施方案中，用于将CAR插入T细胞中的核苷酸构建体具有SEQID述的技术也等同地可适用于对其他类型的淋巴细胞进行遗传改造以抑制自噬基因的表达[0090]本发明人设计并测试了数种靶向自噬相关基因5(ATG5)的基因座的单指导RNA和自噬活性。为了确定将在人T细胞中产生最佳编辑和扩增的转染参数，本发明人随后用sgRNA和重组Cas9蛋白质进行了一系列电穿孔。本发明人将这些电穿孔参数与腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)载体组合使用以将αFR嵌合受体靶向至健康供体T细胞中这些结果是由于通过将ATG5cDNA递送至基因间基因座并恢复自噬功能的中靶(on-物的添加)之后，本发明人确定了在健康供体T细胞中产生80％以上的得失位形成的RNP递同源指导修复成功地产生了24.1％的ATG5-/-αF[0094]图D示出了CD8+T细胞的抗体耗竭(使用抗CD8抗体实现)导致Atg5-/-小鼠的肿瘤控[0095]图8示出了评价Atg5-/-CD8+T细胞的代谢组学并示出了Atg5-/-CD8+T细胞糖酵解更[0097]图G示出了Atg5+/-和Atg5-/-CD8+T细胞的Hxk2表达的定量RT-PCR。结果与Actb相离的Atg5+/-和Atg5-/-CD8+T细胞中所测定的。数据表示为平均值+/-SEM。n＝4至5只小鼠/[0098]图J示出了对在肿瘤植入之后第14天(10,000个细胞)收获的来自荷瘤Atg5-/[0099]图9示出了表明Atg5缺陷导致效应记忆CD8+T细胞提高的实验的结果。图A示出了图A的左侧两张图像示出了代表性流式细胞术图，其示出了在对来自Tramp-C2荷瘤小鼠的Atg5+/-和Atg5-/-CD8+T细胞进行PMA/离子霉素刺激之后的IFNγ和TNFα表达。示出于图A右侧的图表示e0771和Tramp-C2荷瘤小鼠中IFNγ+TNFα+CD8+T细胞的百分比+/-SEM，其中Atg5-/-细胞的百分比更高。图B示出了通过ELISA分析的来自e0771或Tramp-C2荷瘤小鼠的荷瘤小鼠收获的脾细胞，并进行IFNγELISPOT测定。数据表示为平均值+/-SEM。*p<-/-T细胞中观察到TNFα和IFNγ提[0101]参照图11，本发明人进行了实验以表明Atg5-/-T细胞在免疫应答基因基因座处具CD8+T细胞独特的H3K4me3-标记启动子的途径和基因本体分析在与T细胞活化和适应性免疫相关的基因中强富集(Benjaminiq值＜10e-12)。图B示出了免疫应答基因子集中H3K27me3和H3K4m3的差异归一化标记密度。图C和D示出了用于Ifng的对Atg5+/-和Atg5-/-Glut1的对Atg5+/-和Atg5-/-CD8+T细胞进行H3K4me3的ChIP-Seq。图E示出了在敲除或对照2只小鼠/组的三次重复实验的平均值+/-SEM。图H至J示出了用于Hk2的对Atg5+/-和Atg5-/-CD8+T细胞进行H3K4me3的ChIP-Seq。图H示出了在敲除或对照CD8+T细胞中Hk2的归一化标记密度。图I示出了Atg5+/-和Atg5-/-CD8+T细胞或(图J)Atg14+/-和Atg14-/-CD8+T细胞中Hk2座处基因编辑的验证。确认了使用CRISPR-Cas9的ATG5的伴随功能性敲除和基因捕获载体ATG5基因的外显子E2和E3显示为空心框。示意性地举例说明了ATG5的内含子2(I2)内的基[0103]图12的图B示出了通过CRISPOR识别的靶向内含子2的不同区域以达到表2中所示配敏感核酸酶来确定指示核酸酶活性的小插入和缺失(得失位)的频率。作为一个实例，[0108]图12的图E示出了out-outPCR，其示出了ATG5的内含子2中的测试SA-2A-4DNucleofector，用与经化学修饰的sgRNA(824)复合的重组SpCas9对用CD3/CD28珠刺激[0110]图14示出了具有GFP报道子的来自用编码构建体的慢病毒转导的人CD8+T细胞的于在AAVS1基因座内插入αFR-CAR作为对照的CAR构建体的序列以SEQIDNO：10和11给出。[0112]图15示出了在CD34+造血干细胞和活化的CD8+T细胞中ATG5和AAVS1的有效靶向(这些实验中不存在供体CAR构建体)。图A是示出了在用Cas9蛋白质和100至300pmol指定24.1％的细胞是期望的ATG5-/-α用表3中所示的sgRNA序列将靶向ATG5的sgRNA电穿孔到ATG5基因的外显子4或外显子5中的策略。图A示出了用于将构建体并入T细胞中并在外显子4(靶标56)或外显子5(靶标150)处[0117]前述实施例表明，可将期望的抗原靶向受体构建体在淋巴细胞(例如T细胞)基因DeterminesTumorRejectionKineticsandPersistenceofCART-cells.Cancerhigh-gradeserousovariancancerrevealsCD20，FoxP3andTIA-1aspositive[0124]5.CheungA，etal.，2016.Targetiassociatewithfavorableoutcomeinvascularizedhigh-gradeserousovarian[0127]8.VanderHeidenMG，DeBerardinisRJ.2017.Understandingthe[0129]10.ChangCH，etal.，2015.MetabolicCompetitionintheTumorcellMitochondrialBiogenesistoDriveIntratumoralT-cellMetabolic[0134]15.PuaHH，HeYW.2009.Aut[0135]16.SchlieK，etal.，2015.SurvivalofeffectorCD8+T-cellsduring[0136]17.PulestonDJ，etal.，2014.AutophagyisacriticalregulatorofmemoryCD8+T-cellformation.Elife3[0137]18.QuX，etal.，2003.Promotionoftumorigenesisbyheterozygous[0139]20.MacintyreAN，etal.，2014.TheglucosetransporterGlut1isselectivelyessentialforCD4T-cellactivationandeffectorfunction.Cell[0140]21.HultquistJF，etal.，2016.ACas9RibonFunctionalGeneticStudiesofHIV-HostInteractionsinPrimaryHumanT-[0141]22.EyquemJ，etal.，2017.TargetingaCARtotheTRAClocuswith[0142]23.DeVorkinL，etal.，2019.Autophagyregulationofmetabolismis[0144]25.Schlieetal.，2015.SurvivalofeffectorCD8+T-Cellsduring[0002]<110>省卫生服务局[0003]拉瓦尔大学[0004]<120>用于增强的淋巴细胞介导的免疫治疗的组合物和方法[0005]<130>B5370163/JAM[0006]<150>US62/804,658[0007]<151>2019-02-12[0009]<170>PatentInversion3.5[0013]<213>人工序列[0015]<223>靶标719[0017]gctacggaaagtcagattac20[0021]<213>人工序列[0023]<223>靶标696[0025]gtaatctgactttccgtagc20[0029]<213>人工序列[0031]<223>靶标824[0033]gcaccgagtagtaccacttg20[0037]<213>人工序列[0039]<223>靶标950[0041]aagttcggcaatcttgttac20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶标905<400>5cggatcgctgcctaatgtta<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶标945<400>6ccgtttatgtatccttagtc<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶标710<400>7gtcacgttctcctacctagt<210>8<211>10041<212>DNA<213>人工序列<220><223>pAAV_ATG5_C4-CD27CD3z-CAR.xdna<400>8ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggcctaagcttgagcggagttccaattgtactgtacagcacatagacttgcaggtgtgagttaatggattatgtattttacaaacacttttcaaatgtcttctgattttggtgtgctttgtttcccttttctaagtgcatgtataatcccagtttatgcctctgtcag[0078]agatgacatcctgcctgttcactgaatagcccataataggcaaagatattctcaattgtc360[0079]gttactgttttttctttttgtgtctcaggtatgcattctagtgtttacctggagatgatg420[0080]tggaaaagtagaagtgtatttgtgatgaggaaatgcttcttctgtttcactttaatgaag480[0081]tctgccctttgctttccccctcatctctctgagaggcagtgctgctcctcagcctgctcc540[0082]agctacggaaagtcagattactggaggaagctacttattaaggagcccattcgctcactt600[0083]tttgggtataggactgtttttttgtttttgttttcctctgtgcatcctcagcatctggca660[0084]caggctcctcaaaagcttctgacctcttctcttcctcccacagggcctcgagagatctgg720[0085]cggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccc780[0086]tatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccag840[0087]gccgggatcccagctggtggagtctgggggaggcttggtacagccagggcggtccctgag900[0088]actctcctgcacaacttctggattcacttttggtgattatgctatgatctgggcccgcca960ggctccagggaaggggctggagtgggtctcatccattagtagtagtagtagttacatatactacgcagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagaacgatacgatttttggagtggaatggacgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcgagtggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtagtgcacagtctgccctgactcagcctgcctccgtgtctgggtctcctggacagtcgatcaccatctcctgcactggaaccagcagtgatgttgggagttataaccttgtctcctggtaccaacagcacccaggcaaagcccccaaactcatgatttatgagggcagtaagcggccctcaggggtttctaatcgcttctctggctccaagtctggcaacgcggcctccctgacaatctctgggctccaggctgaggacgaggctgattattactgccagtcctatgacagcagcctgagtgtggtattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtgctagcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgccaacgaaggaaatatagatcaaacaaaggagaaagtcctgtggagcctgcagagccttgtcgttacagctgccccagggaggaggagggcagcaccatccccatccaggaggattaccgaaaaccggagcctgcctgctcccccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgtttt2040ggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctca2100ggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgg2160gatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtac2220agccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataagc2280ggccgcctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttcct2340tgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgc2400attgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaaggggg2460aggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggtcgacgtg2520gtactactcggtgcatgaatgtttccccaggctcatgttgggattttgtttgaaatcatc2580tttatgggttttcttactagaaatgatagttttagagaagttcggcaatcttgttactgg2640tactcaagcttatatacacgtgagtaatcttaactttggaaatatcaaccgttttctgtc2700tagaaaaacatccacagttaaaaaccaagtatggtcatagttttatttttagaagaattt2760catttgttagaggtattttttctgttcttgttctgtaatataggttaggataccattttt2820tttttccaaacaagtttttgctgttttaattacaacttttaaccttcattggctttgtaa2880tagtatataagagtatgtgagagtataagagtatatttggccaaattgacaacaactggg2940taccctcgagcgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgc3000tcgctcactgaggccgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgca3060gctgcctgcaggggcagcttgaaggaaatactaaggcaaaggtactgcaagtgctcgcaa3120cattcgcttatgcggattattgccgtagtgccgcgacgccgggggcaagatgcagagatt3180gccatggtacaggccgtgcggttgatattgccaaaacagagctgtgggggagagttgtcg3240agaaagagtgcggaagatgcaaaggcgtcggctattcaaggatgccagcaagcgcagcat3300atcgcgctgtgacgatgctaatcccaaaccttacccaacccacctggtcacgcactgtta3360agccgctgtatgacgctctggtggtgcaatgccacaaagaagagtcaatcgcagacaaca3420ttttgaatgcggtcacacgttagcagcatgattgccacggatggcaacatattaacggca3480tgatattgacttattgaataaaattgggtaaatttgactcaacgatgggttaattcgctc3540gttgtggtagtgagatgaaaagaggcggcgcttactaccgattccgcctagttggtcact3600tcgacgtatcgtctggaactccaaccatcgcaggcagagaggtctgcaaaatgcaatccc3660gaaacagttcgcaggtaatagttagagcctgcataacggtttcgggattttttatatctg3720cacaacaggtaagagcattgagtcgataatcgtgaagagtcggcgagcctggttagccag3780tgctctttccgttgtgctgaattaagcgaataccggaagcagaaccggatcaccaaatgc3840gtacaggcgtcatcgccgcccagcaacagcacaacccaaactgagccgtagccactgtct3900gtcctgaattcattagtaatagttacgctgcggccttttacacatgaccttcgtgaaagc3960gggtggcaggaggtcgcgctaacaacctcctgccgttttgcccgtgcatatcggtcacga4020acaaatctgattactaaacacagtagcctggatttgttctatcagtaatcgaccttattc4080ctaattaaatagagcaaatccccttattgggggtaagacatgaagatgccagaaaaacat4140gacctgttggccgccattctcgcggcaaaggaacaaggcatcggggcaatccttgcgttt4200gcaatggcgtaccttcgcggcagatataatggcggtgcgtttacaaaaacagtaatcgac4260gcaacgatgtgcgccattatcgcctggttcattcgtgaccttctcgacttcgccggacta4320agtagcaatctcgcttatataacgagcgtgtttatcggctacatcggtactgactcgatt4380ggttcgcttatcaaacgcttcgctgctaaaaaagccggagtagaagatggtagaaatcaa4440taatcaacgtaaggcgttcctcgatatgctggcgtggtcggagggaactgataacggacg4500tcagaaaaccagaaatcatggttatgacgtcattgtaggcggagagctatttactgatta4560ctccgatcaccctcgcaaacttgtcacgctaaacccaaaactcaaatcaacaggcgccgg4620acgctaccagcttctttcccgttggtgggatgcctaccgcaagcagcttggcctgaaaga4680cttctctccgaaaagtcaggacgctgtggcattgcagcagattaaggagcgtggcgcttt4740acctatgattgatcgtggtgatatccgtcaggcaatcgaccgttgcagcaatatctgggc4800ttcactgccgggcgctggttatggtcagttcgagcataaggctgacagcctgattgcaaa4860attcaaagaagcgggcggaacggtcagagagattgatgtatgagcagagtcaccgcgatt4920atctccgctctggttatctgcatcatcgtctgcctgtcatgggctgttaatcattaccgt4980gataacgccattacctacaaagcccagcgcgacaaaaatgccagagaactgaagctggcg5040aacgcggcaattactgacatgcagatgcgtcagcgtgatgttgctgcgctcgatgcaaaa5100tacacgaaggagttagctgatgctaaagctgaaaatgatgctctgcgtgatgatgttgcc5160gctggtcgtcgtcggttgcacatcaaagcagtctgtcagtcagtgcgtgaagccaccacc5220gcctccggcgtggataatgcagcctccccccgactggcagacaccgctgaacgggattat5280ttcaccctcagagagaggctgatcactatgcaaaaacaactggaaggaacccagaagtat5340attaatgagcagtgcagatagagttgcccatatcgatgggcaactcatgcaattattgtg5400agcaatacacacgcgcttccagcggagtataaatgcctaaagtaataaaaccgagcaatc5460catttacgaatgtttgctgggtttctgttttaacaacattttctgcgccgccacaaattt5520tggctgcatcgacagttttcttctgcccaattccagaaacgaagaaatgatgggtgatgg5580tttcctttggtgctactgctgccggtttgttttgaacagtaaacgtctgttgagcacatc5640ctgtaataagcagggccagcgcagtagcgagtagcatttttttcatggtgttattcccga5700tgctttttgaagttcgcagaatcgtatgtgtagaaaattaaacaaaccctaaacaatgag5760ttgaaatttcatattgttaatatttattaatgtatgtcaggtgcgatgaatcgtcattgt5820attcccggattaactatgtccacagccctgacggggaacttctctgcgggagtgtccggg5880aataattaaaacgatgcacacagggtttagcgcgtacacgtattgcattatgccaacgcc5940ccggtgctgacacggaagaaaccggacgttatgatttagcgtggaaagatttgtgtagtg6000ttctgaatgctctcagtaaatagtaatgaattatcaaaggtatagtaatatcttttatgt6060tcatggatatttgtaacccatcggaaaactcctgctttagcaagattttccctgtattgc6120tgaaatgtgatttctcttgatttcaacctatcataggacgtttctataagatgcgtgttt6180cttgagaatttaacatttacaacctttttaagtccttttattaacacggtgttatcgttt6240tctaacacgatgtgaatattatctgtggctagatagtaaatataatgtgagacgttgtga6300cgttttagttcagaataaaacaattcacagtctaaatcttttcgcacttgatcgaatatt6360tctttaaaaatggcaacctgagccattggtaaaaccttccatgtgatacgagggcgcgta6420gtttgcattatcgtttttatcgtttcaatctggtctgacctccttgtgttttgttgatga6480tttatgtcaaatattaggaatgttttcacttaatagtattggttgcgtaacaaagtgcgg6540tcctgctggcattctggagggaaatacaaccgacagatgtatgtaaggccaacgtgctca6600aatcttcatacagaaagatttgaagtaatattttaaccgctagatgaagagcaagcgcat6660ggagcgacaaaatgaataaagaacaatctgctgatgatccctccgtggatctgattcgtg6720taaaaaatatgcttaatagcaccatttctatgagttaccctgatgttgtaattgcatgta6780tagaacataaggtgtctctggaagcattcagagcaattgaggcagcgttggtgaagcacg6840ataataatatgaaggattattccctggtggttgactgatcaccataactgctaatcattc6900aaactatttagtctgtgacagagccaacacgcagtctgtcactgtcaggaaagtggtaaa6960actgcaactcaattactgcaatgccctcgtaattaagtgaatttacaatatcgtcctgtt7020cggagggaagaacgcgggatgttcattcttcatcacttttaattgatgtatatgctctct7080tttctgacgttagtctccgacggcaggcttcaatgacccaggctgagaaattcccggacc7140ctttttgctcaagagcgatgttaatttgttcaatcatttggttaggaaagcggatgttgc7200gggttgttgttctgcgggttctgttcttcgttgacatgaggttgccccgtattcagtgtc7260gctgatttgtattgtctgaagttgtttttacgttaagttgatgcagatcaattaatacga7320tacctgcgtcataattgattatttgacgtggtttgatggcctccacgcacgttgtgatat7380gtagatgataatcattatcactttacgggtcctttccggtgatccgacaggttacggcct7440gatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaa7500ccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagc7560gtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttccttt7620ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttc7680cgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgt7740agtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttcttt7800aatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattctttt7860gatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaa7920aaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaattttatggtgcactctcagt7980acaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgac8040gcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctcc8100gggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggc8160ctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtca8220ggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacat8280tcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaa8340aggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattt8400tgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcag8460ttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagt8520tttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcg8580gtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcag8640aatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagta8700agagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctg8760acaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgta8820actcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgac8880accacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactactt8940actctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggacca9000cttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgag9060cgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgta9120gttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgag9180ataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactt9240tagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgat9300aatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgta9360gaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaa9420acaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctt9480tttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtag9540ccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgcta9600atcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactca9660agacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacag9720cccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaa9780agcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcgga9840acaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtc9900gggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagc9960ctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttt10020gctcacatgtcctgcaggcag<210>9<211>10035<212>DNA<213>人工序列[0246]<223>pAAV_ATG5_C4-CD28CD3z-CAR.xdna[0248]ctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgaccttt60[0249]ggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcact120[0250]aggggttcctgcggcctaagcttgagcggagttccaattgtactgtacagcacatagact180[0251]tgcaggtgtgagttaatggattatgtattttacaaacacttttcaaatgtcttctgattt240tggtgtgctttgtttcccttttctaagtgcatgtataatcccagtttatgcctctgtcagagatgacatcctgcctgttcactgaatagcccataataggcaaagatattctcaattgtcgttactgttttttctttttgtgtctcaggtatgcattctagtgtttacctggagatgatg420tggaaaagtagaagtgtatttgtgatgaggaaatgcttcttctgtttcactttaatgaag480tctgccctttgctttccccctcatctctctgagaggcagtgctgctcctcagcctgctccagctacggaaagtcagattactggaggaagctacttattaaggagcccattcgctcactt600tttgggtataggactgtttttttgtttttgttttcctctgtgcatcctcagcatctggca660caggctcctcaaaagcttctgacctcttctcttcctcccacagggcctcgagagatctggcggcggagagggcagaggaagtcttctaacatgcggtgacgtggaggagaatcccggccctatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccag840gccgggatcccagctggtggagtctgggggaggcttggtacagccagggcggtccctgag900actctcctgcacaacttctggattcacttttggtgattatgctatgatctgggcccgcca960ggctccagggaaggggctggagtgggtctcatccattagtagtagtagtagttacatatactacgcagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagaacgatacgatttttggagtggaatggacgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcgagtggtggaggcggttcaggcggaggtggctctggcggtagtgcacagtctgccctgactcagcctgcctccgtgtctgggtctcctggacagtcgatcaccatctcctgcactggaaccagcagtgatgttgggagttataaccttgtctcctggtaccaacagcacccaggcaaagcccccaaactcatgatttatgagggcagtaagcggccctcaggggtttctaatcgcttctctggctccaagtctggcaacgcggcctccctgacaatctctgggctccaggctgaggacgaggctgattattactgccagtcctatgacagcagcctgagtgtggtattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtgctagcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccatcgatagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaa2040gagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaagg2100cctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaa2160aggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccac2220caaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataagcggccgc2280ctgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccc2340tggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtc2400tgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggatt2460gggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggtcgacgtggtacta2520ctcggtgcatgaatgtttccccaggctcatgttgggattttgtttgaaatcatctttatg2580ggttttcttactagaaatgatagttttagagaagttcggcaatcttgttactggtactca2640agcttatatacacgtgagtaatcttaactttggaaatatcaaccgttttctgtctagaaa2700aacatccacagttaaaaaccaagtatggtcatagttttatttttagaagaatttcatttg2760ttagaggtattttttctgttcttgttctgtaatataggttaggataccattttttttttc2820caaacaagtttttgctgttttaattacaacttttaaccttcattggctttgtaatagtat2880ataagagtatgtgagagtataagagtatatttggccaaattgacaacaactgggtaccct2940cgagcgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctc3000actgaggccgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcc3060tgcaggggcagcttgaaggaaatactaaggcaaaggtactgcaagtgctcgcaacattcg3120cttatgcggattattgccgtagtgccgcgacgccgggggcaagatgcagagattgccatg3180gtacaggccgtgcggttgatattgccaaaacagagctgtgggggagagttgtcgagaaag3240agtgcggaagatgcaaaggcgtcggctattcaaggatgccagcaagcgcagcatatcgcg3300ctgtgacgatgctaatcccaaaccttacccaacccacctggtcacgcactgttaagccgc3360tgtatgacgctctggtggtgcaatgccacaaagaagagtcaatcgcagacaacattttga3420atgcggtcacacgttagcagcatgattgccacggatggcaacatattaacggcatgatat3480tgacttattgaataaaattgggtaaatttgactcaacgatgggttaattcgctcgttgtg3540gtagtgagatgaaaagaggcggcgcttactaccgattccgcctagttggtcacttcgacg3600tatcgtctggaactccaaccatcgcaggcagagaggtctgcaaaatgcaatcccgaaaca3660gttcgcaggtaatagttagagcctgcataacggtttcgggattttttatatctgcacaac3720aggtaagagcattgagtcgataatcgtgaagagtcggcgagcctggttagccagtgctct3780ttccgttgtgctgaattaagcgaataccggaagcagaaccggatcaccaaatgcgtacag3840gcgtcatcgccgcccagcaacagcacaacccaaactgagccgtagccactgtctgtcctg3900aattcattagtaatagttacgctgcggccttttacacatgaccttcgtgaaagcgggtgg3960caggaggtcgcgctaacaacctcctgccgttttgcccgtgcatatcggtcacgaacaaat4020ctgattactaaacacagtagcctggatttgttctatcagtaatcgaccttattcctaatt4080aaatagagcaaatccccttattgggggtaagacatgaagatgccagaaaaacatgacctg4140ttggccgccattctcgcggcaaaggaacaaggcatcggggcaatccttgcgtttgcaatg4200gcgtaccttcgcggcagatataatggcggtgcgtttacaaaaacagtaatcgacgcaacg4260atgtgcgccattatcgcctggttcattcgtgaccttctcgacttcgccggactaagtagc4320aatctcgcttatataacgagcgtgtttatcggctacatcggtactgactcgattggttcg4380cttatcaaacgcttcgctgctaaaaaagccggagtagaagatggtagaaatcaataatca4440acgtaaggcgttcctcgatatgctggcgtggtcggagggaactgataacggacgtcagaa4500aaccagaaatcatggttatgacgtcattgtaggcggagagctatttactgattactccga4560tcaccctcgcaaacttgtcacgctaaacccaaaactcaaatcaacaggcgccggacgcta4620ccagcttctttcccgttggtgggatgcctaccgcaagcagcttggcctgaaagacttctc4680tccgaaaagtcaggacgctgtggcattgcagcagattaaggagcgtggcgctttacctat4740gattgatcgtggtgatatccgtcaggcaatcgaccgttgcagcaatatctgggcttcact4800gccgggcgctggttatggtcagttcgagcataaggctgacagcctgattgcaaaattcaa4860agaagcgggcggaacggtcagagagattgatgtatgagcagagtcaccgcgattatctcc4920gctctggttatctgcatcatcgtctgcctgtcatgggctgttaatcattaccgtgataac4980gcca