第四节结构研究法

第四节结构研究法化合物的纯度测定结构研究的主要程序结构研究中采用的主要方法一、化和物的纯度测定方法：检查有无均匀一致的晶形，有无明确、敏锐的熔点（熔距一般为1~2℃）及色谱法。其中色谱法包括：TLC、PC、GC、HPLC。二、结构研究的主要程序1.初步推断化合物类型2.测定分子式，计算不饱和度。3.确定分子式中含有的官能团，或结构片段，或基本骨架。4.推断并确定分子的平面结构5.推断并确定分子的主体结构（构型、构象）文献检索、调研工作贯穿结构研究工作的整个过程。利用中、外文主题索引按中药拉丁文学名进行检索，来获得已分出化合物的种类、个数、性质、用到的提取方法、提取溶剂、色谱的溶剂系统、生物活性等信息。获得文献后，最好整理成一览表以方便检索比较。已知化合物，还需做混合熔点测定和混合的IR光谱；未知化合物，需按测定程序进行，如有不对称中心，还需测定绝对构型。三、结构研究中采用的主要方法1.确定分子式，计算不饱和度

a.元素定量分析配合分子量测定

元素定性分析，如钠融法，分析化合物中含有几种元素。

元素定量分析—确定各元素百分含量，根据倍比定律确定分子中的原子比

分子量测定：冰点下降法、沸点上升法、粘度法、凝胶滤过法及质谱法。刺果甘草中分离的一白色结晶元素定性分析：含有C,H,O元素定量分析:C79.35%,H10.21%,O10.44%原子比为10.16：15.58：1，约化为10：16：1质谱得到其分子量为456所以最后确定其分子式为C30H48O3b.同位素丰度比法c.高分辨质谱（HR-MS）法

HR-MS还可以给出化合物的精确分子量。从氢核磁共振波谱和碳核磁共振波谱中可直接获得碳氢的个数，再结合质谱给出的分子量的信息，就可以得到氧的个数，用这种方法也能确定化合物的分子式。

d.不饱和度u=Ⅳ－Ⅰ/2＋Ⅲ/2＋1Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ分别代表一、三、四价原子的数目。2.质谱法常用的质谱有：电子轰击质谱（EI

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MS）、场解析电离质谱（FD-MS）、快原子轰击质谱（FAB-MS）、电喷雾电离质谱（ESI-MS）等。质谱常用于确定分子量，并可求算分子式和提供其它结构信息。3.红外光谱利用分子中价键的伸缩及弯曲振动在4000~625cm-1红外区域引起的吸收，而测得的吸收图谱。包括特征频率区和指纹区可用于鉴别羟基、氨基、双键、芳环等特征官能团以及芳环取代类型。羟基羰基特征区指纹区4.紫外-可见吸收光谱由电子能级跃迁产生的吸收图谱，在200~700nm范围内含有共轭双键、发色团及具有共轭体系的助色团分子的化合物具有紫外-可见吸收。主要用来推断化合物的骨架类型。5.核磁共振波谱（NMR）核磁共振波谱是化合物分子在磁场中受到另一射频磁场的照射，当照射场的频率等于原子核在外磁场的回旋频率时，有磁距的原子核就会吸收一定的能量产生能级的跃迁，即发生核磁共振，以吸收峰的频率对吸收强度作图所得到的图谱。

1H–NMR和13C-NMR，能提供分子中有关氢及碳原子的类型、数目、互相连接方式、周围化学环境以及构型、构象等结构信息。在进行中药有效成分的结构测定时，NMR谱与其它光谱相比其作用更为重要。

（1）1H-核磁共振（1H–NMR）1H–NMR通过测定化学位移（δ）、质子数以及裂分情况（重峰数及偶合常数J）可以得出分子中1H

的类型、数目及相邻原子或原子团的信息。化学位移（δ）：是指1H核因为周围化学环境的不同，其外围电子云密度，以及绕核旋转时产生的磁的屏蔽效应也就不同。在一定的外磁场作用下其回旋频率也不同，因而需要相应频率的射频磁场才能发生共振而得到吸收信号。这些信号将会出现在不同的区域，我们在实际应用当中以四甲基硅烷TMS为内标物，将其化学位移定为0，测定各质子共振频率与它的相对距离，这个相对值就是质子的化学位移值。质子数：过去是根据氢谱的上峰的积分面积并结合已知的分子式求得每个信号所相当的氢的个数，现在1H–NMR可以直接给出每个信号代表的质子的个数，并可以直接获得分子中总的质子数。信号的裂分及偶合常数：磁不等同的两个或两组1H核在一定距离内会因相互自旋偶合干扰而使信号发生裂分，而出现单峰，双峰，多重峰等。裂分间的距离称为偶合常数。其大小取决于间隔键的距离。按间隔键的多少可分为偕偶、邻偶及远程偶合。

此外还有同核去偶、重氢交换，加入反应试剂、及各种双照射技术等许多帮助结构分析的辅助技术。

（2）13C-核磁共振（13C-NMR）

脉冲傅立叶变换核磁共振技术及计算机的引入，才使13C-NMR得以投入实际应用。13C-NMR在确定化合物结构时比1H–NMR起着更为重要的作用。

13C-NMR中常应用的参数是碳核的化学位移，异核偶合常数（JCH）及弛豫时间（T1），其中我们常应用的是化学位移。13C-NMR谱中13C-13C之间的偶合很弱，一般不予考虑，而1H-13C之间的偶合作用却很强。常见的13C-NMR谱类型及其特征a.噪音去偶谱（全氢去偶或宽带去偶）采用宽频电磁辐射照射1H，使其对13C偶合全部消除，13C信号以单峰形式出现，对于判断其化学位移十分方便。b.选择氢核去偶及远程选择氢核去偶：对某个氢核进行选择性照射，以消除其偶合影响，与之相关联的13C信号发生改变，根据峰的裂分变化情况，结合化学位移，可以推断分子中存在的片段结构。c.DEPT谱：通过改变照射1H核的脉冲宽度（θ）或设定不同的弛豫时间，使不同类型的13C在图谱上呈现单峰并分别呈现正向峰或倒置峰。

θ=45˚时季C信号消失，其它都向上θ=90˚

时季C信号消失CH3,CH2信号消失

CH↑θ=135˚

时季C信号消失

CH3,CH↑CH2↓

（3）二维核磁共振波谱（2D-NMR）2D-NMR技术使一维核磁共振谱中复杂和堆积难于分辨的信号得以识别。

包括：同核的

1H-1H化学位移相关（1H-1HCOSY）谱，异核的13C-1HCOSY谱、以及NOESY（示氢核之间的NOE关系）谱等。同核的1H-1H化学位移相关谱（1H-1HCOSY），是同一个偶合体系中质子之间的偶合相关谱。可以用来确定质子的化学位移以及质子之间的偶合关系和连接顺序。

1H检测的异核化学位移相关谱特别是13C-1H化学位移相关谱，对于鉴定化合物的结构是十分重要的方法。它包括HMQC谱和HMBC谱。HMQC谱是通过1H检测的异核多量子相关谱，此谱反映1H核和与其直接相连的13C的关联关系。

HMBC谱是通过1H检测的异核多键相关谱，反映1H核和与其远程偶合的13C的关联关系。

4.NOESY谱（1H核之间NOE相关）

NOE效应：选择照射一种质子使其饱和，则与该质子在立体空间位置上接近的另一个或数个质子信号强度增高的效应称为核的Overhauser效应，简称NOE。NOE主要用来确定两种质子在分子立体空间结构中是否距离相近，若存在NOE，则表示相近；NOE越大，则两者在空间的距离就越近。NOE是确定分子中某些基团的位置，立体构型和优势构象的重要手段之一。

NOESY谱是为了在二维图谱上观察NOE效应而开发出来的新技术。在其谱中，空间相近的质子间NOE效应可以观测到，并能作为相关峰出现在图谱上。6.旋光光谱（ORD）用不同波长的偏振光照射光学活性