（正式版）DB32∕T 2583-2013 《饲料中饲用芽孢杆菌的测定》

备案号：40469-2014DB32饲料中饲用芽孢杆菌的测定2014-01-20实施2014-01-20实施江苏省质量技术监督局发布本标准编写按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准由江苏省农业科学院畜牧研究所、江苏省动物卫生监督所负责起草。本标准主要起草人为宦海琳、周维仁、闫俊书、白群安。11范围本标准规定了饲料中饲用芽孢杆菌的测定方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、预混料、饲料添加剂中饲用芽孢杆菌的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T20195动物饲料试样的制备GB/T4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定(原文中的参考文献)3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。一类能形成芽孢(内生孢子)的杆状细菌的通称。与饲料工业密切相关的芽孢杆菌主要为芽孢杆菌孢杆菌(Bacilluscoagulans)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)和短芽孢杆菌属(Brevilbacillus)的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)。3.2饲料检样经过处理，在一定条件下(如培养基、培养温度和培养时间等)培养后，所得每g(mL)检样中形成的微生物菌落总数。取一定量检样的稀释液，将其在80℃下加热10min,涂布在NA琼脂内，于36℃条件下培养48h,菌落计数，算出每g(mL)检样中的芽孢杆菌总数。5设备和材料5.1分析天平感量0.1g,0.1mg。5.2振荡器5.3粉碎机25.5恒温培养箱5.6pH计(精确到±0.1个单位)或精密pH试纸1mL(具0.01刻度)、10mL(具0.1ml刻度)或微量移液器及吸头。5.11灭菌玻璃或塑料培养皿纯度的水。参见附录中的A.3。参见附录中的A.6。3参见附录中的的A.10。参见附录中的A.11。按照GB/T14699.1进行采样，采样工具如铲子、匙、8.1.1以无菌操作称取试样25g(mL),放于含有225mL0.85%灭菌生理盐水的灭菌三角瓶中(瓶内预置适当数量的玻璃珠),置振荡器上振荡30min,经充分振摇后，制成1:10的均匀稀释液。8.1.2用无菌吸管或微量移液器吸取1mL的1:10稀释液，沿管壁慢慢注入含有9mL灭菌生理盐水的试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管，制成1:100的稀释液。根据样品含菌量，做进选择2个-3个适宜的稀释度，水浴80℃±1℃维持10min,每个稀释度吸取0.1mL稀释液接种到两个营养琼脂平板上，使用涂布棒进行表面涂布。涂布好的平皿盖好，置室温中放置15min使接种物完全被琼脂吸收。翻转上述平皿置36℃±1℃培养箱中培养48h±2h。平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平8.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用；而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释2,代表一个平板菌落数。9.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平9.1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式(1)计算。∑C——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；d-稀释因子(第一稀释度)。示例：1:100000(第一稀释度)1:1000000(第二稀释度)菌落数(CFU)上述数据按9.2.2数字修约后，表示为25000000或2.5×10⁷。9.1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可9.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计9.1.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。9.1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于3009.2芽孢杆菌总数的报告9.2.2菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。9.2.3称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。10芽孢杆菌的鉴定(可选择)致，可以按照商品说明书使用这些试剂盒或生化自平板上挑取5个菌落，分别划线接种于营养琼脂平板上，36℃±1℃培养箱中培养48h±2h,从每一平板上选取至少一个良好分离的特征菌落，转接保存，进行鉴定将挑选纯化的菌落做革兰氏染色镜检，饲用芽孢杆菌的菌落特征及染色镜检见表110.4生理生化鉴定5菌种枯草芽孢杆菌(B.subulis)圆形或蔓延成波浪形、不规则性，灰白色或微黄色细胞为杆状，有芽孢，芽孢椭圆形，中氏阳性地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)明，扁平，边缘不整齐呈毛发状细胞为杆状，单个、成对或短链排列，阳性凝结芽孢杆菌(B.coagulans)细胞为杆状，单个、成对或短链排列，短小芽孢杆菌(B.pumilus)迟缓芽孢杆菌(B.lentus)细胞为杆状，芽孢椭圆形，中生或近中侧孢芽孢杆菌(B.laterosporus)细胞为杆状，芽孢为椭圆形，侧生、中一++一一++++—一一产酸++d++一D—木糖++d+++++d++一明胶++一+d++++一+一利用++d+一一一十一+一硝酸盐还原++d一d++十+十一一++一+dd一++一一一附录A(规范性附录) 名称重量 牛肉膏3g 氯化钠5g 加热溶解，校正pH至7.2±0.2,分装烧瓶，121℃高压灭菌20min。名称结晶紫1%草酸铵水溶液名称碘碘化钾将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。2A.2.4.1将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min,水洗。A.2.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗。A.2.4.3滴加95%乙醇脱色，约15s～30s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.2.4.4滴加复染液，复染1min。水洗、待干、镜检。A.3V-P测定A.3.1.1成分蛋白胨氯化钠溶解各成分与水中，必要时加热。调整pH使培养基为7.0±0.2,分装试管，115℃高压灭菌30min。A.3.2试剂A.3.3试验方法A.4芽孢杆菌糖发酵管名称氯化钾酵母膏0.04%溴甲酚紫A.4.2制法除指示剂溴甲酚紫外，其余各成分溶解于水，必要时加热。调整pH使培养基为7.0±0.2,加入指示剂溴甲酚紫，分装试管，115℃高压灭菌30min。A.4.3试验方法挑取小量培养物接种于上述培养基中，37℃±1℃培养2d～5d,观察指示剂变黄，表示产酸，为阳性；不变或变蓝(紫)为阴性。A.5明胶液化3名称蛋白胨牛肉膏明胶蒸馏水加热溶解，校正至pH7.4±0.2,分装小管，121℃高压灭菌10min,取出后迅速冷却使其凝固。用琼脂培养物穿刺接种，放在20℃~25℃培养，每天观察结果，记录液化时间。或放在36℃±1℃培养，每天取出，放冰箱内30min后再观察结果。名称蛋白胨牛肉膏氯化钠蒸馏水加热溶解于蒸馏水内，校正pH至7.2±0.2,分装烧瓶，121℃高压灭菌20min。A.6.2试剂取新鲜斜面培养基点种于上述平板，室温培养2d～5d,形成明显菌落后，在平板上滴加碘液，平板呈蓝黑色，菌落周围若有不变色透明圈，表示酵母浸膏磷酸氢二钾磷酸二氢钾氯化钠丙二酸钠A.7.2制法除指示剂外，其余各成分溶解于水，必要时加热。调整pH至7.0±0.2,加入指示剂，分装试管，121℃高压灭菌20min。4A.7.3试验方法用新鲜的琼脂培养物接种，于36℃±1℃培养48h,观察结果。阳性者由绿色变为蓝色；培养基不变色为阴性。A.8柠檬酸盐利用A.8.1成分氯化钠A.8.2制法加热溶解，调整pH至7.0±0.2,加入指示剂，分装试管，121℃高压灭菌20min。A.8.3试脸方法用琼脂培养物接种整个斜面，在36℃±1℃培养7d,每天观察结果。阳性者培养基变为红色，否则为阴性。A.9硝酸盐还原A.9.1培养基A.9.1.1成分硝酸钾蛋白胨加热溶解，调整pH至7.0±0.2,分装试管，每管约5mL,121℃高压灭菌15min。A.9.2试剂甲液乙液甲萘胺0.1g二苯胺试剂A.9.3试验方法接种后在36℃±1℃培养2d～4d,加入甲液和乙液各一滴，观察结果。若溶液变为红色、橙色、棕色为硝酸盐还原阳性。若无红色出现，可加1滴～2滴二苯胺试