（正式版）DB37∕T 2037-2012 《牛白细胞黏附缺陷症(BLAD)基因分子检测技术规程》

DB37DB37/T2037—2012牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）基因分子检测技术规程TechnicalSpecificationofMolecularDetectionforBovineLeukocyteAdhesionDeficiency(BLAD)Gene2012-02-09发布2012-03-01实施山东省质量技术监督局发布I1SN/T1917-2007牛地方流行性白牛BLAD发病原因是由于CD18亚单位编码区的383位碱基由A突变为G引起的。基于该2用酚-氯仿抽提法从抗凝血或者血凝块中提取基因组DNA。抗凝血和血凝块的预处理按照SN/T1917-2007的规定执行。DNA的提取按照NY/T1672-2008中的规定执行。也可用商业化DNA提取试剂盒从细管中取出精液放入1.5mL离心管中，然后，加入500µL生理盐水，混匀，除去卵黄稀释液及精轻轻混匀，12000rpm离心10min；吸取上清液，转至1.5mL离心管中，加入150µL酚和150µL氯仿，轻轻混匀5min；吸取上清液，加入500µL无水乙醇（4℃保存），轻轻颠倒混合；用灭菌枪头将白色沉淀挑25µL反应体系：10×Buffer2.5µL、50mmol/LMgCl21.2µL、10mmol/LdNTP0.6µL、TaqDNA聚合酶2U、10µmol/L引物各1.0µL、模板DNA594℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保37.5.3将混合液缓慢倒入制胶板中，排除气泡，插入多齿梳子。待凝胶移至水平电泳槽中，往电泳槽中加入1×TAE缓冲液，使电泳缓冲液没过胶面。7.5.4将待检PCR产物5μL和上样缓冲液(6×DNALoadingBuffer)以5:1的比例混合均匀，加入点样孔；同时选择点样孔点上5μL2000bpDNAMarker作参照。恒压100V,电泳30min。电泳结束后牛CD18基因PCR扩增产物仅出现874bp的条带(图1),则表示扩增特异性好，可进行下一步的测序图1牛CD18基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱PCR扩增的CD18基因片段测序结果见附录C。如图2所示，将PCR产物测序结果利用DNAstar软件进行比对，CD18基因PCR扩增产物的第501位碱基为A时，且测序峰图为单峰，表明是纯合基因型AA,该个体表述为正常牛；第501位碱基为A或G时，且测序峰图为套峰，表明是基因型AG,属于杂合子，该个体表述为BLAD携带牛；第501位碱基为G时且测序峰图为单峰，表明基因型是纯合的GG时，该个体表述为BLADWw图2牛CD18基因PCR产物测序结果45A.210%SDS(十二烷基硫酸钠)：100A.40.5mol/LNaCl（A.9TE缓冲液取1mol/LTris.HCl（pH8.0）10mL，0.5m1mol/LTris-HCl(pH=8.0)1mL，0.56在10mL水中加入100mg的溴化乙锭（EB），溶解后分装成72μL，10μL，20μL，100μL，8使用温度范围45-135℃,最高使用压力0.255Mpa。温控范围50-300℃,箱内尺寸350*350*450mm。91ATTGACAAGGAAAGAAGTCGTTACAAGTGCAGGTG61ACTAGGGCAGCTGGGATTGAGGAAGTGGGGGGGGGTGTCCCAGGATGG121TTTGGGGCCCTGGCAGTTTGCTTAGCAGCTGGTGG181AGAGAGATAGTAGAATGATTAACAGTGTGATAACA241CACATATGTATCCAGATGTTTCTATGTCAGAACGTGTGCTTGCCTGA301TAGGCATCCTGCATCATATCCACCAGCATAAGAGAATGGGGAGAG361GCCTGACAAGATGCCATAAGTGCCCATGAACCCCCCCCACCCCCA421CCTGACTATCTCCCAAATCCTGGCAGGTCAGGCAGTTGCGTTCAACGTGA481GGCCAAGGGCTACCCC541TGACCTCGTCAACGTCAAGAAGCTGGGGGGTGACCTGCTCCGGGC601CGAGTCGGGCCGCATTGGTGAGGCAGCTACTCCATCTTCCCCTGAAAC661TCCCAGGCACCTCTGCACCTCTGCACCCCAAGGGCAGGGCGCCAGGCC721CCGGGCCTTCCTACCCCT