《木薯原生质体再生植株技术规程》（征求意见稿）

Q/LB.□XXXXX-XXXX木薯原生质体再生植株技术规程范围本文件属于木薯组织培养再生技术。本文件规定了诱导木薯脆性胚性愈伤组织（FEC）、原生质体制备、原生质体培养、愈伤组织悬浮培养、体细胞胚胎诱导、胚胎再生植株的实验方法和步骤。本文件适用于木薯胚性愈伤组织的诱导与离体培养、原生质体培养、木薯遗传转化以及细胞融合再生等生物技术领域。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T1520木薯DB33/T752植物种苗组培快繁技术规程术语和定义下列术语和定义适用于本文件。

植物细胞全能性指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。

原生质体指去掉细胞壁的裸露的有活性的细胞。缩略词FEC：脆性胚性愈伤组织CIM：诱导胚胎培养基，适用于芽、嫩叶等外植体MSN：诱导胚胎培养基，适用于胚性愈伤组织GD：胚性愈伤组织的维持和增殖培养基SH：悬浮培养基，胚性愈伤组织的维持和增殖TM2G：培养原生质体的培养基CMM：胚状体成熟培养基CEM：生芽伸长培养基MS：生根和组培苗继代培养基2,4-D：2,4一二氯苯氧乙酸6-BA：6-苄基腺嘌呤NAA：萘乙酸ZT：玉米素原理木薯外植体在含特定激素的培养基上能诱导胚性愈伤组织，再用胚性愈伤组织分离原生质体，利用植物细胞的全能性，木薯原生质体能分裂增长成胚性愈伤组织，然后分化成胚状体长成完整植株。整个过程是：外植体→胚性愈伤组织→原生质体→胚性愈伤组织→胚状体→完整植株。培养基配方及溶液配制见附录A、B、C、D。操作步骤诱导胚性愈伤组织诱导循环胚胎将组培苗外植体（嫩叶、芽等）在含12mg/LPicloram的CIM培养基中诱导初生胚胎，每2w换一次培养基，将产生的初生胚胎用镊子挑出，继续在CIM培养基上培养2～4m，诱导循环胚胎。诱导胚性愈伤组织诱导的循环胚胎，放在GD培养基上培养1～2m，将循环胚胎表面产生的细小颗粒分离，再在GD培养基上增值培养，不断循环，形成脆性胚性愈伤组织（FEC）。建立悬浮系+取脆性胚性愈伤组织约1g，转移至约30mLSH液体培养基中，置于摇床，于25°C，光照强度800～1000lx，转速110～130r/min下震荡悬浮培养。每隔2～3d继代1次，继代5～15d后使用。分离纯化原生质体酶解取继代5～15d的愈伤组织悬浮系，用镊子除去大颗粒，吸管吸除液体培养基，称取1g组织，用约12mL酶液酶解。酶液由10g/L纤维素酶，0.4g/L离析酶，0.1g/L果胶酶，368mg/LCaCl2，34mg/LKH2PO4，740mg/LKNO3，492mg/LMgSO4·7H2O，19.2mg/LNa-EDTA，14mg/LFeSO4·7H2O，91g/L甘露醇，0.5g/LMES，1mg/LNAA，1mg/L2,4-D组成。在25°C、40r/min、黑暗条件下酶解18h。纯化采用梯度离心法。将酶解好的组织经45μm不锈钢网筛过滤，可能是由于液体表面张力的作用，酶液很难自动流下，一般需要很久，这时给不锈钢筛网一个外力，酶液很快就流下过滤了。滤液转入10mL离心管，在960r/min下离心6min，弃上清液，沉淀用1～1.5mLCPW13盐悬浮。在另一干净的离心管加入3～4mLCPW26盐，然后缓缓加入CPW13盐悬浮的原生质体，960r/min离心3min，中间界面出现一条清晰的带。再用吸管将原生质体带吸出，用TM2G液体培养基悬浮，960r/min离心6min，弃上清液，沉淀再用TM2G培养基悬浮。原生质体培养将纯化的原生质体用TM2G液体培养基悬浮，采用液体浅层法培养。TM2G培养基中葡萄糖浓度为0.30～0.36mol/L，原生质体培养密度为5×105个/mL。在6cm无菌塑料培养皿中培养，每皿约1.5mL培养基，在28°C、黑暗条件下培养。培养前30d，每10d用新鲜的TM2G（葡萄糖0.30mol/L）培养基更换，此后每10d用新鲜的TM2G（葡萄糖0.25mol/L）培养基更换。悬浮培养原生质体在TM2G液体培养基培养45d后，把大的致密愈伤组织挑出（其它的继续培养）转移至SH液体培养基中悬浮培养，7～15d更换1次新鲜培养基，在SH培养基增殖2～4w。胚胎发生将在SH培养基增殖的愈伤组织转至MSN固体培养基上（光照）分化胚状体，产生的胚状体分别在CMM培养基上培养1～4w发育成绿色的大子叶胚，再将成熟的绿色大子叶胚转至CEM培养基，1～2m后茎开始伸长。当伸长的茎长至2～3cm时，手术刀切下，接入MS培养基，1w即可生根。从原生质体到再生完整植株一般需要6～7个月。移栽培养土先经高温高压灭菌。将清洗干净的再生苗移栽到盛满培养土的营养钵中，每一个营养钵种植1株，种植后浇透定根水。

（规范性）

MS盐和维生素大量元素g/L微量元素mg/L铁盐mg/L有机物mg/LKNO3NH4NO3KH2PO4MgSO4·7H2OCaCl2·2H2O1916.51.713.74.4KIH3BO3ZnSO4·7H2ONa2MoO4·2H2OCuSO4·5H2OCoCl2·6H2OMnSO4·H2O0.836.28.60.250.0250.02516.9FeSO4·7H2ONa2·EDTA27.837.3甘氨酸肌醇烟酸VB6VB121000.50.50.1

（规范性）

培养基组成及作用培养基培养阶段/作用组成CIM诱导胚胎MS盐和维生素（附录A）、2μMCuSO4、12mg/LPicloram、20g/L蔗糖、8g/L琼脂MSN诱导胚胎MS盐和维生素（附录A）、2μMCuSO4、1mg/LNAA、20g/L蔗糖、8g/L琼脂CMM胚胎成熟MS盐和维生素（附录A）、2μMCuSO4、0.1mg/L6-BA、20g/L蔗糖、8g/L琼脂CEM生芽伸长MS盐和维生素（附录A）、2μMCuSO4、20g/L蔗糖、8g/L琼脂，其中6-BA1.0mg/LMS生根和组培苗继代MS盐和维生素（附录A）、0.02mg/LNAA、20g/L蔗糖、8g/L琼脂GDFEC的维持和增殖GD盐和维生素（附录C）、12mg/LPicloram、20g/L蔗糖、8g/L琼脂SH悬浮培养，FEC的维持和增殖SH盐和MS维生素（附录C）、12mg/LPicloram、60g/L蔗糖TM2G原生质体培养TM-2盐和维生素（附录C）、1mg/LNAA、0.5mg/LZT，葡萄糖54-64.8g/L

（规范性）

GD、SH、TM2G培养基组成GDSHTM2G大量元素mg/LCa(NO3)2·2H2OKClKH2PO4KNO3MgSO4·7H2ONH4NO3CaCl2·2H2ONH4H2PO4208.8165.00300.001000.0035.001000.0025004002003001701500370440微量元素mg/LCoCl2·6H2OCuSO4·5H2OH3BO3KIMnSO4·H2ONa2MoO4·2H2OZnSO4·7H2OFeSO4·7H2ONa2·EDTA0.0250.0250.300.801.000.0250.300.2780.3360.10.25.01.0100.11.015200.0250.0256.200.3816.90.258.6013.918.5维生素mg/L甘氨酸肌醇烟酸VB6VB1叶酸生物素D-泛酸钙氯化胆碱酸水解酪蛋白L-半胱氨酸苹果酸抗坏血酸硫酸腺嘌呤L-谷氨酰胺核黄素4.00100.001.001.0010.000.50.50.146002.51100.50.050.500.101501100.50401000.25GDSHTM2G其他g/L蔗糖琼脂葡萄糖甘露醇木糖醇山梨醇MES2086054-64.84.563.804.560.098激素mg/LPicloramNAA玉米素121210.5

（规范性）

CPW盐配方CPWstockI(100mL)CPWstockII(100mL)KH2PO40.272gCaCl21.5