《木薯原生质体再生植株技术规程》（征求意见稿）编制说明

项目来源和起草单位根据广西木薯产业协会《关于下达2021年第一批团体标准制定项目计划的通知》文，《木薯原生质体再生植株技术规程》由广西壮族自治区亚热带作物研究所提出并起草，计划于2022年12月完成。项目背景及目的意义木薯（ManihotesculentaCrantz）别名树薯、番薯，属于大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot）灌木。木薯是一种重要的粮食和工业原料作物。广西是我国木薯种植和加工的重要基地，种植面积和产量均占全国的60%以上。我国木薯种植区域以山地、坡地为主，不易进行机械化生产。随着我国经济发展，人工成本逐年提高，且近些年受病虫害爆发影响，造成木薯减产、产值低，木薯种植面积有减少趋势，需选育高产、高淀粉、抗病虫害等抗逆性强的木薯新品种，替代老化品种，促进木薯产业健康发展。木薯起源于南美洲，具有遗传背景复杂、基因型高度杂合、花粉育性和种子萌发率低、有性子代性状严重分离特性。我国木薯资源匮乏，而其他国家对种质资源日益重视和严加保护使得木薯种质引进日益困难，造成了我国木薯常规育种困难。广西作为木薯主产区，在广西的气候条件下，木薯开花结果难，这使得广西的木薯常规杂交育种难上加难。因此我们必须寻求新的方法。生物技术育种方法已经成为克服传统常规育种方法局限性的有效手段，是常规育种的补充，在木薯品质改良上有很大潜力。随着细胞工程和基因工程的发展，生物技术育种越来越显示了其相对于传统育种方法的优势，是克服传统常规育种方法局限性的有效手段，是常规育种的补充，在木薯品质改良上有很大潜力。而组织培养再生技术是木薯生物技术的重要组成部分。本技术规范的制订能为木薯组织培养提供技术指导，也为生物技术改良木薯品种奠定基础。标准编制过程第一阶段：前期研究标准编制组多年来致力于促进广西木薯产业新技术新产品的研究、开发推广、交流和展示，在团体标准《木薯原生质体再生植株技术规程》立项前就开展了诱导脆性胚性愈伤组织、原生质体制备、原生质体培养、愈伤组织悬浮培养、体细胞胚胎诱导、体细胞胚胎再生植株等生物技术领域研究。第二阶段：成立起草小组项目立项后，广西壮族自治区亚热带作物研究所成立了标准编制组，按工作要求进行了任务分工。编制组在对收集的文献、标准等资料进行认真分析、比对研究的基础上，对实验数据进行整理，总结分析，初步确定了标准草案框架。第三阶段：标准起草标准编制组召开内部研讨会，就标准的主体内容和关键性技术指标进行了研讨，对实验进行了反复实验验证，形成了标准草案，在标准文本格式上请了标准化技术机构的相关人员进行把关，最后完善了草案形成了标准征求意见稿。第四阶段：征求意见标准编制起草小组通过发函征求广西大学、广西区种子管理站、广西轻工业科学技术研究院有限公司、广西壮族自治区亚热带作物研究所和广西农业职业技术学院5家单位和高校的意见建议，同时于2022年8月30日—2022年9月30日在广西木薯产业协会网站上公开征求意见，共收回征求意见表5份，反馈意见23条，其中采纳21条，不采纳2条。标准编制小组根据收集到的意见处理修改完善标准征求意见稿，形成了标准送审稿。标准主要章节内容及确定依据主要内容《木薯原生质体再生植株技术规程》团体标准共分为6章：第1章规定了标准的适用范围，介绍了标准内容；第2章列出了标准的规范性引用文件；第3章术语、定义和缩略词，规范了“植物细胞全能性”和“原生质体”的术语和定义，解释了缩略词FEC、CIM、MSN、GD、SH、TM2G、CMM、CEM、MS、2,4-D、6-BA、NAA、ZT代表的含义；第4章原理，植物细胞有全能性，木薯原生质体能分裂增长成胚性愈伤组织，然后分化成胚状体长成完整植株；第5章培养基配方及溶液配制；第6章操作步骤，包括诱导胚性愈伤组织、建立悬浮系、分离纯化原生质体、原生质体培养、悬浮培养、胚胎发生、移栽。适用范围本文件规定了木薯原生质体再生技术的原理和操作步骤。本标准适用于木薯胚性愈伤组织的诱导与离体培养、原生质体培养、木薯遗传转化以及细胞融合再生等生物技术领域。规范性引用文件本标准根据GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》规定的格式编写，内容和要求参考了相关文件以及标准等，等同引用了现行有效的国家标准、行业标准、地方标准，并符合相关法律法规的规定，具体如下：NY/T1520-2007木薯DB33T752-2009植物种苗组培快繁技术规程主要技术指标确定的依据和来源标准中主要技术内容为第6章。国内外关于木薯愈伤组织的诱导、愈伤组织建立悬浮系及悬浮培养、分离纯化原生质体的研究报道较多，经过查阅大量文献、实验验证确认在含12mg/LPicloram的CIM培养基中诱导组培苗嫩叶、芽等，能诱导出体细胞胚胎，将体细胞胚胎放在GD培养基上培养，能诱导出脆性胚性愈伤组织（FEC），脆性胚性愈伤组织能够在SH液体培养基中悬浮培养，生长迅速。愈伤组织悬浮系在由10g/L纤维素酶，0.4g/L离析酶，0.1g/L果胶酶，368mg/LCaCl2，34mg/LKH2PO4，740mg/LKNO3，492mg/LMgSO4·7H2O，19.2mg/LNa-EDTA，14mg/LFeSO4·7H2O，91g/L甘露醇，0.5g/LMES，1mg/LNAA，1mg/L2,4-D组成的酶液中酶解，经梯度离心能分离原生质体。关于原生质体培养、胚胎发生的研究报道较少，经查阅相关文献、设计实验方案、实验验证得出标准的技术参数。原生质体培养浓度的确定将纯化的原生质体用TM2G液体培养基悬浮，采用液体浅层法培养。TM2G培养基中葡萄糖浓度设6个梯度，依次为0.39、0.36、0.33、0.30、0.27、0.24mol·L-1，培养密度为5×105，培养3-10d观察。当葡萄糖浓度在0.39mol·L-1时，只有部分细胞分裂，多数细胞皱缩死亡；浓度为0.30-0.36mol·L-1时，均可正常分裂，杂质较少；浓度为0.27mol·L-1时，部分细胞涨破死亡，形成很多碎片；浓度为0.24mol·L时，细胞全部涨破死亡。表明在葡萄糖浓度介于0.30-0.36mol·L-1时，适合培养木薯原生质体。胚胎发生的培养基确定考虑到由原生质体再生的致密愈伤与胚性愈伤组织（FEC）性质上相同，因此直接采用FEC为材料摸索胚状体分化的试验条件。具体方法是将FEC分别接种于木薯体细胞胚诱导培养基CIM和胚状体发生培养基MSN上，各3皿，分别在光、暗条件下培养，培养温度为25℃，每3周更换新鲜培养基。培养观察，在光、暗条件下，FEC在CIM培养基上均不长胚状体。FEC在MSN培养基上，在光条件下，2周后开始胚状体生长，之后不断大量长出胚状体，同时愈伤组织不断增殖；FEC在MSN培养基上，在暗条件下，4周后才开始长胚状体，之后也不断长出胚状体，但数量明显不如在光下。因此，选择MSN培养基光照条件下，培养原生质体长成的致密愈伤组织分化胚状体。与其他标准、相关法律法规的关系目前，与木薯相关的现行有效国家标准3项，行业标准28项，广西地方标准33项，主要包括木薯栽培技术、间套种、常见病虫害检疫鉴定方法、木薯淀粉初加工机械质量评价技术规范等方面，暂未查到木薯原生质体再生植株技术相关的国外标准。通过查询《中华人民共和国国家标准发布公告》、《中华人民共和国行业标准备案公告》、《中华人民共和国地方标准备案公告》等数据库，国内暂无木薯原生质体再生植株技术的强制性国家标准、行业标准。本标准(征求意见稿)的制定是遵循《中华人民共和国标准化法》等国家相