DB53T 1059.4-2021 滇金丝猴检疫技术 第4部分：志贺杆菌实验室检测技术规范

CCSB41云南省市场监管局发布53QuarantinetechniqueforRhinopithecusb—Part4:TechnicalspecificationsforlaboratoryexaminationofShigellaspp.DB53/T1059.4—2021I前言 III Ⅴ 12规范性引用文件 13术语和定义 14缩略语 25总则 26志贺杆菌分类 27仪器设备和试剂 37.1采样用品 37.2实验器材 37.3试剂及参考菌株 38样品 48.1采样要求 48.2采样程序 48.3样品保存与运输 49试验步骤 49.1细菌分离培养与生化试验 49.2志贺杆菌DPCR分群检测 510试验数据处理 610.1培养及染色特性判读 610.2生化试验结果判读 610.3核酸检测结果及判定 7附录A（规范性）培养基及试剂配制 8附录B（规范性）采样记录表 9附录C（规范性）革兰染色程序 DB53/T1059.4—2021本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起本文件是DB53/T1059《滇金丝猴检疫技术》的第3部分。DB53/T1059已经发布了以下部分：——第1部分：产气荚膜梭菌实验室检测技术规范；——第2部分：毛首线虫实验室检测技术规范；——第3部分：隐孢子虫实验室检测技术规范；——第4部分：志贺杆菌实验室检测技术规范。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由云南省林业与草原局、云南省市场监督管理局共同提出。本文件由云南省林业标准化技术委员会（YNTC02）归口。本文件主要起草单位：云南农业大学、云南省标准化研究院。本文件主要起草人：陈培富、黄艳梅、胡世享、李宁、卓娜、李杰、何依蓉、钱丽敏、杨建发、邹丰才。DB53/T1059.4—2021Ⅴ滇金丝猴（Rhinopithecusbieti）是中国特有珍稀濒危灵长类动物，属于国家Ⅰ级重点保护野生动物，列入《世界自然保护联盟》（IUCN）濒危物种红色名录。编制并发布DB53/T1059《滇金丝猴检疫技术》地方标准，推进滇金丝猴疫病诊断的标准化和规范化，指导从事野生动物保护相关的专业人员按规范程序实施对滇金丝猴相关病原的实验室检测，为滇金丝猴的科学研究和保护工作提供病原或疫病调查的基础数据，为滇金丝猴检疫、疫病监测和防治提供重要的参考依据，促进滇金丝猴繁育和扩群，维护地区物种与生态平衡，提升生物多样性保护成效。本文件已发布4个部分：——第1部分：产气荚膜梭菌实验室检测技术规范。本部分从产气荚膜梭菌实验室检测技术的总则、产气荚膜梭菌分型、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范；——第2部分：毛首线虫实验室检测技术规范。本部分从毛首线虫实验室检测技术规范的试验原理、试验条件、仪器设备和试剂、样品采集与保存、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范；——第3部分：隐孢子虫实验室检测技术规范。本部分从隐孢子虫实验室检测技术的试验原理、试验条件、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范；——第4部分：志贺杆菌实验室检测技术规范。本部分从志贺杆菌实验室检测技术涉及的总则、志贺杆菌分类、仪器设备和试剂、样品、试验步骤、试验数据处理等方面制定了规范。DB53/T1059.4—20211滇金丝猴检疫技术第4部分：志贺杆菌实验室检测技术规范重要提示：本文件涉及人兽共患病原体的操作，应在符合国家相关生物安全规定（GB19489和NY/T541）的条件下进行。涉及活体动物的操作应考虑动物福利。本文件规定了滇金丝猴（Rhinopithecusbieti）检疫技术中志贺杆菌实验室检测技术的总则、志贺杆菌分类、仪器设备和试剂、样品、试验步骤和试验数据处理。本文件适用于滇金丝猴检疫技术中志贺杆菌实验室检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GBl9489实验室生物安全通用要求NY/T54l兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1志贺杆菌Shigellaspp.肠杆菌科中的一个属，是灵长类细菌性痢疾的病原。3.2带菌者carriers无临床表现，从粪便中分离到志贺杆菌的个体。3.3保定physicalrestraint采用化学或物理方式，让动物固定保持某种姿势或某个体位，以便于救护人员进行检查、采样或治疗。可用麻醉药物或镇静剂保定，也用特制笼具、平台、布袋、绳索以及其它方式保定。3.4平板划线platestreaking用灭菌接种环蘸取含菌样品，在琼脂平板表面上作多次由点到线的划线稀释而获得较多独立分布的单个微生物细胞，并让其成长为单菌落的纯培养方法。3.5凝集试验agglutinationtestDB53/T1059.4—20212颗粒性抗原（如细胞）与特异性抗体结合，形成肉眼可见的沙粒样免疫复合物的一类血清学反应，用于定性及定量检测抗原或抗体。3.6分型血清typingsera单价分型血清仅含有针对某特定类型的抗原（如细菌O抗原）的特异性抗体，多价分型血清包含针对至少3个特定类型的抗原（如细菌O抗原）的特异性抗体。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BLAST：基于局部序列比对算法的搜索工具Basiclocalalignmentsearchtoolbp：碱基对BasepairddH2O：双蒸水DoubledistilledwaterdNTP：脱氧核苷酸DeoxyribonucleotidetriphosphateDPCR：双重PCRDualpolymerasechainreactionipaH：侵袭性质粒抗原HInvasiveplasmidantigenHMAC：麦康凯MacConkeyPCR：聚合酶链式反应PolymerasechainreactionprpB：磷蛋白质磷酸酶BPhosphoproteinphosphataseBTAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸钠Tris-Acetate-EDTATE：三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸钠Tris-EDTATris：三羟甲基氨基甲烷Tris(hydroxymethyl)aminomethaneTSI：三糖铁TripleSugarIronXLD：木糖-赖氨酸-脱氧胆盐Xylose-Lysine-Deoxycholate5总则5.1分离培养：采集滇金丝猴腹泻粪样检测志贺杆菌，做增菌培养后，再做选择性培养，以提高志贺杆菌检出率。5.2培养特性观察：对选择性培养得到的分离菌株做革兰染色和培养特性观察，获得革兰染色呈阴性且在三糖铁高层斜面琼脂中斜面产碱、底层产酸、不产氢气和硫化氢，在半固体琼脂斜面试管中无运动力的分离菌株。5.3细菌生化试验：对符合5.2培养特性的分离菌株做细菌生化试验，依据分离菌株生化特性对其做出志贺杆菌分类的基本判定。5.4分子鉴定：使用DPCR扩增分离菌株核酸：检测5.2或5.3的分离菌株，做出分子鉴定。6志贺杆菌分类志贺杆菌属分为4个群或种：a)A群即痢疾志贺杆菌（S.dysenteriae），有10个血清型，是唯一不能发酵甘露醇的志贺杆菌；b)B群即福氏志贺杆菌（S.flexneri），有13个血清型，各型间有血清学交叉反应；c)C群即鲍氏志贺杆菌（S.boydii），有18个血清型；DB53/T1059.4—20213d)D群即宋内志贺杆菌（S.sonnei），只有1个血清型，是唯一表达鸟氨酸脱羧酶和β-半乳糖苷酶的志贺杆菌。7仪器设备和试剂7.1采样用品7.1.1个人防护装备，包括防护服、乳胶手套或聚乙烯手套、+/-N95或FFP2面罩、护目镜、鞋套7.1.2样品采集及记录用品，包括装有保存介质的采样管或无菌空容器、动物检疫器械箱、人造纤维或聚酯纤维棉签、剪刀、镊子、注射器（带针头）、酒精棉、碘伏棉、酒精灯、封口袋、标签纸、记号笔、记录表格等。7.1.3样品暂存运输装备，包括保温箱、冰盒或液氮容器、吸水填充材料、包装胶带、警示标识等。7.1.4样品保存装备，包括低温冰箱（4℃、–20℃)、超低温冰箱（–80℃)、液氮罐等。7.1.5保定用品，包括操作笼、防咬嘴套、眼罩及麻醉药物（如氯胺酮注射液）或镇静药物（如舒泰）。7.2实验器材台式离心机、小型离心机、微量可调移液器、恒温水浴锅、旋涡混匀仪、核酸蛋白分析仪、PCR扩增仪、电泳槽、电泳仪等电泳装置、凝胶成像仪、冰箱（4℃和–20℃)、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、液氮罐、电子天平、带滤芯移液头、PCR反应管等。7.3试剂及参考菌株志贺杆菌增菌肉汤、XLD琼脂培养基、MAC琼脂培养基、TSI琼脂、半固体和营养琼脂斜面、β-半乳糖苷酶、尿素、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、水杨苷、七叶苷、靛基质、甘露醇、棉子糖、甘油、葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐、10%十二烷基硫酸钠（SDS）、蛋白酶K（20mg/mL）、氯化钠（5mol/L）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）/氯化钠溶液（10%CTAB和0.7mol/L氯化钠）、三氯甲烷、异戊醇、70%乙醇、异丙醇、TE溶液、10×PCR缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、DPCR分群检测所用引物（见表1）、TAE电泳缓冲液、志贺杆菌分型血清、志贺杆菌参考菌株（阳性对照菌株）、阴性对照菌株（如沙门氏菌或大肠埃希菌）。部分培养基及试剂配制方法见附录A。表1志贺杆菌DPCR分群检测所用引物序列ipaHprpBprpBhypotheticalproteinSHTDB53/T1059.4—202148样品8.1采样要求8.1.1采样人员应为兽医或动物保护相关的专业技术人员。8.1.2开展采样工作前，应了解、掌握采样区域内滇金丝猴的种群数量、活动规律、生活习性及保定方法，制定样品采集、运输和保存等完整的技术方案，并办理样品采集和运输相关手续，确保采样过程的科学性、安全性以及样品的可溯源性。样品可采集动物园或饲养基地圈养的金丝猴，但应得到相应主管部门的许可。8.1.3采样安全与防护。采样人员应规范穿戴全套个人卫生安全防护装备做好自我防护。与样品直接接触的器具均应提前做灭菌处理以防样品被污染。应准备垃圾袋带回采样过程中产生的所有废弃物品，避免污染环境和造成疫病传播。8.1.4采样完成后，所使用的器械、容器、个人防护用品等均要进行无害化处理。8.2采样程序8.2.1采集滇金丝猴粪便时需选取新鲜（未干涸变色变样）粪便，同一堆粪便只采集一份样品（可分装于多只采集管内），且尽量采取粪便内部未被氧化部分，不成形粪便应避免采取粪便中的白色部分。除对已排泄的粪样进行采集，还可采集病死猴肛门棉拭子。8.2.2采集粪便时用棉签蘸取粪便放入对应采集管中，每采集一个样品更换一个棉签，并做好样品标记和采样记录。记录包括样品编号、采集管数、种群、采集地名、采集日期、采集人、经度纬度、海拔、粪样新鲜程度、生境状况等采样信息（见附录B）。在采集粪便样品时，应填写《滇金丝猴采样记录表》（见附录B中表B.1）。8.3样品保存与运输新鲜粪样应放入无菌的螺盖试管或封口塑料袋中保存。采集或处理的样品在4℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应置于−80℃冰箱，不宜反复冻融。样品应立即放入4℃保温箱内并尽快送实验室检查。9试验步骤9.1细菌分离培养与生化试验9.1.1增菌培养以无菌操作取检样25g(mL)，加入装有灭菌225mL志贺杆菌增菌肉汤的均质杯，用旋转刀片式均质器以8000r/min～10000r/min均质：或加入装有225mL志贺杆菌增菌肉汤的均质袋中，用拍击式均质器连续均质1min～2min，液体样品振荡混匀即可。于41℃±1℃厌氧培养16h～20h。9.1.2选择性培养取增菌培养后的志贺杆菌悬液，分别采取平板划线法接种于XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺杆菌显色培养基，于36℃±1℃培养20h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态。如出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至48h再进行观察。9.1.3培养特性观察及革兰染色镜检DB53/T1059.4—20215从选择性固体培养基（琼脂平板）上分别挑取符合志贺杆菌典型形态的单个菌落，分别接种于TSI琼脂斜面、半固体琼脂斜面和营养琼脂斜面各1管，置36℃培养20h～24h，观察培养结果。按常规革兰染色程序（见附录C）对细菌进行染色并镜检。9.1.4生化试验及附加生化试验9.1.4.1生化试验取9.1.3培养形成的菌落，进行生化试验，即接种细菌于生化鉴定管，36℃培养20h～24h，观察细菌生长情况。9.1.4.2附加生化试验为排除与志贺杆菌生化特征相似的某些非产气大肠埃希菌（anaerogenicE.coli）和碱性-异型（Alkalescen–Disparbiotype,A-D）细菌，符合9.1.4.1志贺杆菌属生化特性的培养物，还需另加做葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐和黏液酸盐试验（36℃培养24h～48h）。9.2志贺杆菌DPCR分群检测9.2.1细菌基因组DNA的制备9.2.1.1取10.1得到的增菌液1.5mL，加到1.5mL无菌离心管中，13000g离心1min。9.2.1.2吸弃上清液，留取沉淀，加567μLTE溶液（pH8.0），悬浮，加30μL10%SDS和3μL蛋白酶K（20mg/mL），混匀，37℃温浴1h。9.2.1.3加100μL氯化钠（5mol/L），混匀加80μLCTAB/氯化钠溶液，混匀，65℃温浴10min。9.2.1.4加等体积三氯甲烷/异戊醇（体积比为24:1），混匀，13000g离心10min，取上清液，加等体积酚/三氯甲烷/异戊醇(体积比为25:24:1)，混匀，13000g离心10min。9.2.1.5取上清液，加0.6倍体积异丙醇，轻轻混匀，13000g离心10min。9.2.1.6取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加100μLTE溶液（pH8.0）溶解，即为DNA溶液。9.2.1.7若不立即检测，可暂时保存于-20℃冰箱。按9.2.1所述方法制备阴性、阳性对照菌株的增菌液基因组DNA。也可使用商业化的DNA提取试剂盒并按其说明制备模板DNA。9.2.2DNA浓度和纯度的测定取5μLDNA溶液加水梯度稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定260nm和280nm处的光密度值。DNA的浓度按照以下公式计算：c=A×N×50/1000...............................................................................(1)式中：c——DNA浓度，单位为微克每微升(μg/μL)；A——260nm处的吸光值；N——核酸稀释倍数。9.2.3PCR扩增9.2.3.1PCR扩增体系：10×PCR缓冲液2μL，dNTPs（10mmol/L）2μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA（50ng/μL）2μL，志贺杆菌属和任一志贺杆菌群（福氏志贺杆菌、宋内志贺杆菌、鲍氏志贺杆菌或痢疾志贺杆菌）的上游与下游引物（10μmol/L）各0.5μL，补充双蒸水至总体积25μL。DB53/T1059.4—202169.2.3.2PCR扩增程序：94℃预变性3min，94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸60s，进行35个变性-退火-延伸循环，72℃延伸7min，4℃保存扩增产物。9.2.3.3扩增产物检查：取PCR扩增产物，按常规方法做电泳检查，即以1×TAE为电泳缓冲液，做1.5%琼脂糖凝胶电泳（8～10V/cm凝胶）约30min，紫外灯照射检查扩增产物的条带位置是否与预期片段大小相当。10试验数据处理10.1培养及染色特性判读志贺杆菌染色呈革兰阴性（红色），在不同选择性琼脂平板上的菌落特征总结于表2。在XLD和MAC琼脂平板，宋内志贺杆菌的单个菌落直径大于其他志贺杆菌。对凡是TSI琼脂中斜面产碱、底层产酸（发酵葡萄糖但不发酵乳糖和蔗糖）、不产氢气（福氏志贺杆菌6型可产生少量气体）、不产硫化氢，在半固体琼脂斜面试管中无运动力的革兰阴性菌株，进一步挑取其在琼脂平板上生长形成的菌落，做生化试验。表2不同选择性琼脂平板上的志贺杆菌菌落特征粉红色至无色，半透明、光滑、湿润、圆形10.2生化试验结果判读10.2.1对符合10.1描述性质的分离菌株，对照表3和表4在细菌种的水平上做出初步判定。判定为xx志贺杆菌的分离菌株，视需要做血清学分型。志贺杆菌属生化特性见表3。表3志贺杆菌属生化特性---+-----------+---------/+(+)-/+--+++-+-+(+)-(+)d注表示阳性表示阴性/＋表示多数阴性/－表示多数阳性表示迟缓阳性；d表示有不同DB53/T1059.4—2021710.2.2志贺杆菌属和不产气大肠埃希菌、A-D细菌的生化特性区别见表4。表4志贺杆菌属和不产气大肠埃希菌、A-D细菌的生化特性区别----++----dd---d+d注1表示阳性表示阴性；d表示有不同生化型。注2：在葡萄糖胺、西蒙氏柠檬酸盐、粘液酸盐试验三项反应中志贺杆菌一般为阴性，而不产气大肠埃希菌、A-D10.3核酸检测结果及判定10.3.1志贺杆菌属成员经DPCR均可扩增出629bp片段的产物。志贺杆菌不同群存在扩增差异，具体如下：a)痢疾志贺杆菌经DPCR可扩增出173bp片段的产物；b)福氏志贺杆菌经DPCR可扩增出263bp片段的产物；c)鲍氏志贺杆菌经DPCR可扩增出240bp片段的产物；d)宋内志贺杆菌经DPCR可扩增出104bp片段的产物。10.3.2鉴定结果判定：若待检样品检出符合典型的生化特性和PCR产物片段大小的菌株，即可判定该样品为xx志贺杆菌。否则，判定为志贺杆菌阴性。DB53/T1059.4—20218（规范性）培养基及试剂配制A.1XLD琼脂培养基酵母浸出粉：3.0g/L；L-赖氨酸盐酸盐：5.0g/L；木糖：3.75g/L；乳糖：7.5g/L；蔗糖：7.5g/L；去氧胆酸钠：1.0g/L；氯化钠：5.0g/L；硫代硫酸钠：6.8g/L；枸橼酸铁铵：0.8g/L；苯酚红：0.08g/L；琼脂：12.5g/L；蒸馏水：100mL；pH7.