DB5301T 67-2021 马铃薯脱毒组培苗繁育技术规程

ICS65.020.20CCSB23DB5301昆明市市场监督管理局发布DB5301/T67—2021I前言 12规范性引用文件 13术语和定义 14组培室的要求 24.1组培室布局 24.2设施、设备及药品 34.3培养基配方 34.4卫生要求 35脱毒材料的选取 45.1植株初选 45.2材料选择 45.3类病毒筛查 46脱毒与培养 46.1外植体材料预处理 46.2无菌苗培养基的制备 46.3外植体消毒 46.4离体培养无菌苗 56.5茎尖培养基的制备 56.6茎尖剥离与接种 56.7茎尖培养 57病毒检测和品种真实性鉴定 57.1病毒检测 57.2品种真实性鉴定 68核心苗保存与基础苗培养 68.1操作步骤 68.2培养条件 69组培苗扩繁 69.1基础苗复检 69.2培养基制备 69.3无菌接种 79.4扩繁 79.5瓶苗培养 7DB5301/T67—2021附录A（规范性）组培设施、设备及药品 附录B（规范性）MS培养基配方和母液配制要求 附录C（规范性）无菌苗培养基配方 12附录D（规范性）茎尖培养基配方 13附录E（规范性）脱毒苗扩繁培养基配方 附录F（规范性）核心苗保存培养基配方 DB5301/T67—2021本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和本文件起草单位:昆明市农业科学研究院、云南师范DB5301/T67—20211马铃薯脱毒组培苗繁育技术规程2规范性引用文件GB/T29375—2012马铃薯脱毒试管苗GB/T29378—2012马铃薯脱毒种NY/T401—2000脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术3术语和定义3.1应用茎尖分生组织培养技术，脱去主要危害马铃薯3.23.3芽顶端部分（0.1mm～10mm）其中包括分生组织（0.05mm～0.13.43.5DB5301/T67—202123.6指从生长健壮无病虫害的植株上取下用作离体培3.73.8应用茎尖分生组织培养技术获得的，经检测确认不带马铃薯卷叶病毒（PLRV）、马铃等病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVD）、不带任何细菌和真菌，经试种观察具有原3.94组培室的要求4.1组培室布局DB5301/T67—20213图1组培室各功能间布局平面示意图4.2设施、设备及药品4.2.1生产组培苗的设施、设备见附录A。4.2.2生产组培苗的试剂见附录B。4.3培养基配方4.3.1无菌苗培养基配方见附录C。4.3.2茎尖培养基配方见附录D。4.3.3脱毒苗扩繁培养基配方见附录E。4.3.4核心苗保存培养基配方见附录F。4.4卫生要求4.4.1基本要求。组培室各功能间应保持干净、整洁，每周用0.1%的优氯净擦拭工作台面、窗台及拖地面。4.4.2接种室。应定期使用0.25%～1%新吉尔灭擦拭窗台、小推车等，用0.1%的优氯净擦拭地面，隔天开启紫外灯，每次40min～60min。4.4.3培养室。应定期使用0.25%～1%新吉尔灭擦拭培养架和窗台，用0.1%的优氯净擦拭地面。每周开紫外灯1次～2次，每次40min～60min。4.4.4超净工作台。每次使用前，应提前打开风机和紫外灯30min。接种时关闭紫外灯，用75%酒精擦拭工作台面及内壁。每周1次～2次用0.25%～1%新吉尔灭擦拭超净工作台的外表面。4.4.5接种工具。每台超净工作台应备两套接种工具轮流使用。接种前对使用的镊子、剪刀、解剖刀等工具进行灼烧或插入高温灭菌器中灭菌，冷却后使用。4.4.6接种操作人员。进入接种室前，用肥皂或洗手液洗净双手，换上消毒工作服，戴好口罩。操作过程中，每转接完一瓶基础母瓶后用75%的酒精清擦手和工作台面。4.4.7消毒。全自然光培养室门口缓冲间地面消毒槽内应放入消毒剂，工作人员进入时应对鞋底消毒。4.4.8污染瓶苗的处理。组培苗培养期间，经常观察组培苗的状况，发现污染应及时清除，污染瓶苗经高压灭菌后再倒弃。DB5301/T67—202145脱毒材料的选取5.1植株初选5.2材料选择5.2.1选用植株进行培养时，应选取健康且具备品种典型性状植株的顶芽、腋芽或茎段作为外植体材料。5.2.2选用薯块芽进行培养时，在生育后期到收获期，应在已做标记的植株中进行薯块复选。选择高产、大薯率高、无病斑、无虫蛀、无机械损伤，且皮色、肉色、薯形、芽眼等性状符合品种特征的健康薯，清洗泥土后催芽，作为外植体材料。5.3类病毒筛查入选的植株或块茎，按照NY/T401—2000中附录B给出的方法检测马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd），筛选无马铃薯纺锤块茎类病毒（PS6脱毒与培养6.1外植体材料预处理6.1.1植株处理将从田间选择的植株移栽至温室无菌盆土中生长一段时间，定期喷洒6.1.2块茎催芽和病毒钝化6.1.2.1块茎自然出芽：入选的块茎经清洗、消毒后放置于室内常温下自然萌发，待芽长至2cm～3cm即可用于无菌苗的培养。对含有S病毒、X病毒的块茎需置于37℃±1℃培养箱中处理3周～4周，钝化病毒。6.1.2.2人工方法催芽：入选的块茎经清洗后用0.1%硫脲+5mg/L赤霉素溶液浸泡5min，取出晾干后，用0.1%多菌灵溶液浸泡30min或75%酒精喷湿进行表面消毒，置于25℃黑暗条件下催芽，待芽长至2cm～3cm即可用于无菌苗的培养。对含有S病毒、X病毒的块茎需置于37℃±1℃培养箱中处理3周～4周，钝化病毒。6.2无菌苗培养基的制备6.2.1无菌苗培养基可用MS培养基或加激素的MS培养基，配方参见附录B和附录C。6.2.2将制备好的培养基分装于培养容器中，盖好盖子。6.2.3将制备好的培养基在高压蒸汽灭菌锅压力为1.1kg/cm2、温度为121℃条件下灭菌25min～30min，冷却后在洁净贮存室放置3d～5d备用。6.3外植体消毒6.3.1取材：从处理过的块茎上取2cm～3cm长的顶芽和侧芽，或取优选植株的顶芽、腋芽或茎段作为外植体材料。DB5301/T67—202156.3.2清洗：在流水下用软毛刷轻轻逐个刷洗外植体后放于烧杯中，用纱布封口，用自来水冲洗10min～20min。6.3.3消毒：在超净工作台上，先用75%的酒精浸15s，无菌水冲洗2次，再用0.1%的升汞浸泡8min~10min（或用5%次氯酸钠浸泡15min～20min），无菌水漂洗5次～8次。6.4离体培养无菌苗6.4.1接种和培养：在超净工作台上，对经严格消毒过的块茎芽、顶芽、腋芽或茎段等进行剪切，切除下端药剂伤害的部分，接种在MS培养基或加激素的MS培养基上，在培养容器上注明品种名称和接种时间，放入培养室培养3周～4周。待芽长成含4片～5片叶子的小苗时，剪切成单节段，转接于同样的培养基上，培养成苗。同样方法扩繁1个～2个周期，待苗达一定数量后，从无菌苗上剥离茎尖。6.4.2培养条件：无菌苗在温度20℃~25℃、相对湿度70%、光照强度2000Lux～3000Lux的条件下培养，光照时数12h/d。6.5茎尖培养基的制备6.5.1茎尖培养基配方参见附录D。6.5.2将制备好的茎尖培养基分装于培养容器中，盖好盖子。6.5.3将制备好的培养基在高压蒸汽灭菌锅压力为1.1kg/cm2、温度为121℃条件下灭菌25min～30min，冷却后在洁净贮存室放置3d～5d备用。6.6茎尖剥离与接种6.6.1茎尖剥离与接种在超净工作台上操作。6.6.2茎尖剥离与接种按下列步骤进行：a)在解剖镜的载物台上放一张灭菌滤纸，将剪取的无菌苗茎尖放置于滤纸上；b)借助40X双目解剖镜，剥离茎尖直至露出半圆形光滑的生长点；c)用锋利的无菌解剖针切取0.2mm以下的带1个～2个叶原基的茎尖，迅速接种于茎尖培养基上，每瓶培养基内接种一个茎尖；d)已接种的培养基封好口后，在容器上注明编号、品种名称、接种时间。6.6.3在剥离过程中，应注意茎尖暴露的时间越短越好，切下的茎尖不应与已剥去部分、解剖镜台或持芽的镊子接触。每剥一个茎尖后，换一张无菌滤纸。6.7茎尖培养6.7.1培养条件：接种好的茎尖放在培养室内培养，温度20℃~25℃,光照2000Lux～3000Lux，每天光照12h。6.7.2茎尖成苗：茎尖培养两周后，成活的茎尖明显变大变绿，50d～60d左右茎尖长成带1片～2片小叶的无根小芽，转入MS培养基（配方参见附录B）中继续培养，30d左右长成带4片～5片叶子的完整试管苗。7病毒检测和品种真实性鉴定7.1病毒检测DB5301/T67—202167.1.1在超净工作台上取出试管苗将每株按1节～2节切段，转入MS培养基（配方参见附录B）进行培养，每瓶接入一节段，新培养容器仍然使用与试管苗容器相同的编号和内容。7.1.2成苗后，每个编号的抽取一株用于病毒检测，检测方法执行NY/T401—2000的规定，通过检测筛选出不含PVX、PVY、PVS、PLRV、PVM、PVA等病毒和PSTVd的脱毒苗核心苗。7.2品种真实性鉴定7.2.1试种观察：对应编号，将经检测不带病毒的试管苗取出一部分移栽到防虫网棚，结出的小薯种植到田间试种观察，检验其是否发生变异。7.2.2DNA分子标记：鉴定已脱毒的试管苗与原品种的关系，检测方法执行NY/T1963-2010的规定。若试管苗的DNA图谱与原品种的一致，则判定二者为同一品种。8核心苗保存与基础苗培养8.1操作步骤核心苗保存培养基配方见附录F，基础苗扩繁培养基用MS培养基（配方见附录B）或其它脱毒苗扩繁培养基（配方见附录E），步骤如下：a)在超净工作台上，用75%酒精擦拭消毒核心苗瓶和待用的新培养基的瓶表面，并置于超净工作b)用经灼烧消毒并冷却好的镊子取出核心苗置于无菌牛皮纸上；c)按茎节切段，每个切段带1个～2个叶片；d)从剪下的切段中取1段～2段，腋芽朝上插入核心苗保存培养基中上，封好口，注明编号、品种名称及接种时间；将其余节段接入基础苗扩繁培养基，封好口，注明编号、品种名称及接种时间。8.2培养条件8.2.1核心苗保存条件：核心苗保存要放入相对低温的种质资源保存室，使其缓慢生长保存。温度10℃~12℃、相对湿度70%、光照强度2000Lux～3000Lux、光照时数10h/d。8.2.2基础苗培养条件：温度22℃~25℃、相对湿度70%、光照强度2000Lux～3000Lux、光照时数12h/d。9组培苗扩繁9.1基础苗复检按照NY/T401—2000的附录A和附录B给出的方法进行检测。9.2培养基制备9.2.1培养基配制：选择用MS固体培养基（配方参见附录B）或其他扩繁培养基（配方参见附录E）。9.2.2培养基分装：将配制好的培养基装入培养容器中（常用350ml的罐头瓶），每瓶加入35ml~40ml的培养基，用封口膜或盖子封口。DB5301/T67—202179.2.3培养基灭菌：将培养基置于高压蒸汽灭菌锅，在压力为1.1kg/cm2、温度为121℃条件下灭菌25min～30min，取出后在洁净贮存室放置3d～5d待用。9.3无菌接种无菌接种操作要求见第4章。9.4扩繁9.4.1检测合格的基础苗在超净工作台上切段扩繁，组培苗扩繁按以下程序操作：a)用75%酒精擦拭基础瓶苗和备用的培养基，表面消毒后放置于超净工作台上备用；b)打开基础母瓶，用无菌剪刀把苗从基部剪断，用无菌枪状镊子取出脱毒苗，置于事先准备好的无菌牛皮纸上；c)按茎节切断，每个切段带1个～2个叶片；d)用无菌镊子将剪好的茎段插到培养基上，腋芽朝上，每瓶插15个～20个茎段；e)封口后，用记号笔注明编号、品种名称、接种时间。9.4.2每个操作人员配备两套接种工具，交替灭菌使用。每接种完一瓶基础母瓶后，将镊子、剪刀等工具插入75%酒精浸蘸，并在酒精灯上灼烧数秒至酒精干透或插入接种工具消毒器消毒。转接下一个母瓶苗时，应使用另一套消毒好的接种工具，同时换一张无菌牛皮纸。9.5瓶苗培养9.5.1接种好的瓶苗放入培养室，白天22℃~25℃,夜间16℃~20℃,光照采用全自然光或人工光源日光灯：a)全自然光培养：玻璃或阳光板建成的全自然光培养室，光照强度控制在4000Lux～10000Lux，当光照强度超过10000Lux，光照强度过强，不利于组培苗的生长，要进行适当的遮阳；b)人工光源培养：光照强度2000Lux～3000Lux，光照时数16h/d。9.5.2待苗长出6片～7片叶片，株高7cm～8cm时，可再次切段繁殖或出瓶移栽。脱毒苗一般间隔25d左右继代繁殖一次。DB5301/T67—20218（规范性）组培设施、设备及药品A.1组培设施和设备A.1.1防酸碱台面的试验台。A.1.2冰箱。A.1.3药瓶柜。A.1.4器械柜。A.1.5高压灭菌锅。A.1.6干燥箱。A.1.7空调和降温设施（湿帘、风机等）。A.1.8超净工作台。A.1.9培养架（人工光源培养室里的培养架须装有日光灯）。A.1.10浸泡洗涤水槽和冲洗水槽。A.1.11培养瓶控水架。A.1.12装培养瓶（或培养基）的塑料周转筐若干个。A.1.130.1g电子天平、0.0001g电子天平。A.1.14电动搅拌机。A.1.15磁力搅拌机。A.1.16酸度计。A.1.17蒸馏水器。A.1.18不锈钢锅或陶瓷桶。A.1.19电磁炉。A.1.20各种规格的容量瓶、棕色细口瓶、棕色广口瓶、移液管、烧杯、量筒、玻璃棒、吸管、洗耳球、试剂勺等。A.1.21大量的试管、三角瓶、培养瓶A.1.22瓶盖、封口膜、线绳。A.1.23紫外灯。A.1.24酒精灯。A.1.25镊子、剪刀、手术刀、解剖针、解剖刀。A.1.26温、湿度仪。A.2药品A.2.1氯化汞。A.2.2高锰酸钾。A.2.3次氯酸钠。A.2.475%乙醇、95%乙醇。泛酸钙。A.2.6硫脲。DB5301/T67—20219A.2.7新洁尔灭。A.2.8优氯净。A.2.9pH试纸。A.2.10琼脂、卡拉胶。A.2.11食用白糖、蔗糖。A.2.12附录B～附录E中的所有试剂。DB5301/T67—2021（规范）MS培养基配方和母液配制要求B.1MS培养基配方表B.1MS培养配方表硝酸铵(NHNO)磷酸二氢钾(KHPO)O)O)硼酸（HBO）O)2B.2MS培养基母液配制要求B.2.1大量元素母液的配制：大量元素用量相对较大，其中KNO3、NH4