CN113710813B 通过逆向乙醛酸支路生产乙醇酸和甘氨酸的微生物和方法 （布拉斯科公司）

2021.10.14PCT/BR2020/0500412020.02.14WO2020/163935EN2020.08.207.通过逆向乙醛酸支路生产乙醇酸和甘氨酸本发明提供用于通过逆向乙醛酸支路的生产率改善乙醇酸和/或甘氨酸的方法。所述逆向乙醛酸支路包含：催化磷酸烯醇丙酮酸(PEP)羧化为草酰乙酸(OAA)的酶、或催化丙酮酸羧化为草酰乙酸(OAA)的酶乙醛酸和乙酰辅酶A的酶；以及任选的催化草酰乙酸(OAA)转化为苹果酸的酶。乙醛酸还原以生发明的逆向乙醛酸支路途径可以与其它乙醇酸和/或甘氨酸生产途径协同利用以增加生产产27.3中由苹果酰辅酶A裂解酶生产的乙酰辅酶A(c)编码催化丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA(d)编码催化乙醛酸转化为乙醇酸的NADH依赖性的乙醛酸还原酶的基因、或编码催化2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物还包含编码苹果酸脱氢酶的基3.根据权利要求2所述的重组微生物，其中所述编码催化草酰乙酸转化为苹果酸的苹4.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述编码苹果酸硫激酶的基因是来自甲基菌(Methanocaldococcusjannaschii)、热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacter或假单孢菌(Pseudomonas)的sucCD和/或SucCD-2和/或mtk膜甲基球菌(Methylococcuscapsulans)、Nereidaignava、食腐菌生丝微菌(Hyphomicrobiummethylovorum)、活性深海菌(Thalassobiusactivus)、海滨玫瑰杆菌菌(R.sphaeroides)、耻垢分歧杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)或带化红球菌(Rhodococcusfascians)的mcl和/或Mcl1和/或mc6.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述编码丙酮酸羧化酶的基因是来自菜豆根瘤菌(Rhizobiumetli)的pyc、来自酵母的PYC1或PYC2、或来自枯草芽孢杆菌7.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因是4菌、红花烟草(Nicotianatabacum)、籽粒苋(Amaranthushypochondriacus)、普通小麦8.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因是瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)的pck或pckA、来自产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)的pckA、来自牛链球菌(Streptococcusbovis)的pck或11.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述编码NADH依赖性或NADPH依赖性的乙栖热球菌(Thermococcuslitoralis)的gyaR和/或来自拟南芥的(a)编码异柠檬酸脱氢酶的基因，其中所述编码异柠檬酸脱氢酶的基因是来自大肠杆14.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物还包含编码葡萄糖-6-磷酸异15.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述柠檬酸合酶gtlA由SEQIDNO:22组56[0002]本申请要求2019年2月15日提交的题为“通过逆向乙醛酸支路生产乙醇酸和甘氨还涉及使用重组微生物通过逆向乙醛酸支路从碳源(例如己糖或戊糖原料)生产乙醇酸和/或甘氨酸的方法。本申请还涉及包含这些化合物和/或重组微生物中的一种或多种的组合剂生产(拟除虫菊酯杀虫剂)以及食品和饲料添加剂中888公开通过乙醛酸支路(GS)途径生产乙醇酸。美国授权前公开号2014/0295510公开真核0076061和US2015/0147794公开使用以戊糖为基础的糖的乙醇酸生产。尽管开发这些和其[0008]本发明提供的生产乙醇酸和甘氨酸的生物合成途径与现有代谢途径相比具有更7过在至草酰乙酸的丙酮酸和/或磷酸烯醇丙酮酸节点中的碳固定使得碳流改变路线，部分减少或甚至消除在微生物固有代谢和酶促反[0012]在一些实施方案中，本文提供一种用于合成乙醇酸(GA)和/或甘氨酸的生产乙醛苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶[0013]在一些实施方案中，本文提供的是一种用于合成乙醇酸(GA)和/或甘氨酸的生产码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；和(c)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中由苹果酰辅酶A裂解酶产生的乙酰辅酶A与OAA组合以增加GA和/或甘氨酸[0014]在一些实施方案中，本文提供的是一种用于合成乙醇酸(GA)和/或甘氨酸的生产码催化OAA转化成苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因；(c)编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；以及(d)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中由苹果酰辅酶A裂解酶产生的乙酰辅酶A与OAA组合以增加GA[0015]在一些实施方案中，本文提供的是一种用于合成乙醇酸(GA)和/或甘氨酸的生产转化为OAA，和/或编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因，该酶催化磷酸烯醇丙酮酸转化为果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中重组微生物并不[0016]在一些实施方案中，本文提供的是一种用于合成乙醇酸(GA)和/或甘氨酸的生产8码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；(c)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中由苹果酰辅酶A裂解酶产生的乙有降低的磷酸葡萄糖异构酶活性，或更优选地不通过酶磷酸葡萄糖异构酶催化葡萄糖-6-或更优选地通过删除编码催化葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸的磷酸葡萄糖异构酶的CO2有可能通过使用本文所建议的羧化酶和羧激酶被重新并[0017]在本文所述的任一实施方案中的重组微生物可不通过苹果酰辅酶A裂解酶产生的[0018]在本公开的重组微生物中，预计由苹果酰辅酶A裂解酶产生的乙酰辅酶A与OAA组因中包含删除或功能丧失突变，其中所述突变导致苹果酸脱氢酶活性的部分或完全抑制，所述苹果酸脱氢酶活性催化草酰乙酸转化为苹果酸、苹果酸转化为丙酮酸和/或苹果酸转为乙醇酸的NADH依赖性的乙醛酸还原酶的基因、和/或编码催化乙醛酸转化为乙醇酸的[0021]在重组微生物生产甘氨酸的实施方案中，该重组微生物包含编码丙氨酸-乙醛酸将乙醛酸转化为GA和/或甘氨酸的基因中一或yiaE、来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的GOR1、来自海滨栖热球菌(Thermococcus酸脱氢酶来自酶分类(E.C.)1.1.9如，基因mdh可以来自天蓝色链霉菌(S.coelicolor)或基因mdh1/2/3来自酿酒酵母[0028]在一些实施方案中，将苹果酸转化成苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶可以来自酶分来自甲基杆菌属(Methylobacteriumsp.)、扭脱甲基杆菌(Methylobacterium杆菌(Methanothermobacterthermautotrophicus)、根瘤菌(Rhizobium)、荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)或假单孢菌(Pseudomonas)的sucCD和/或SucCD-2和/或[0030]在一些实施方案中，将苹果酰辅酶A转化成乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶来自E.C.4或E.C.4.3.1[0031]在一些实施方案中，在本公开的重组微生物中的编码苹果酰辅酶A裂解酶的基因(Thalassobiusactivus)、海滨玫瑰杆菌(Roseobacterlitoralis)、反硝化生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)、类球红细菌(R.sphaeroides)、耻垢分歧杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)或带化红球菌(Rhodococcusfascians)的mcl和/或Mcl1和/[0032]在一些实施方案中，将丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶可以来自酶分类系统编号E.C.；将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶可以来自E.C.1；将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶可以来自E.C.2和E.C.4.自菜豆根瘤菌(Rhizobiumetli)的pyc、来自酵母的PYC1或PYC2、或来自枯草芽孢杆菌的2/3、来自大豆(G.max)的ppc、或者是来自红嗜热盐菌(Rhodothermus)、棒状杆菌(Corynebacterium)、沙门氏菌(Salmonella)、生丝微菌(Hyphomicrobium)、链球菌(Streptococcus)和链霉菌、泛菌(Pantoea)、芽孢杆菌(Bacillus)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、假单孢菌(Pseudomonas)、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)、红花烟草(Nicotianatabacum)、籽粒苋(Amaranthushypochondriacus)、普通小麦(Triticum可以是来自大肠杆菌的pck或pckA、来自反刍硒单胞菌(Selenomonasruminantium)的pckA、来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的pckA、来自克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)的pckA、来自栖热菌属(Thermussp.)的pckA、来自白瘤胃球菌琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)的pckA、来自牛链球菌(Streptococcusbovis)的pck或pckA，或者来自芽孢杆菌、热纤瘤胃梭状芽孢杆菌(Ruminiclostridium檬酸转化为顺乌头酸的柠檬酸水解酶的基因；(c)编码将顺乌头酸转化为异柠檬酸的D-苏式异柠檬酸水解酶或顺乌头酸酶的基因；(d)编码将异柠檬酸转化为琥珀酸和乙醛酸的异果酸转化为草酰乙酸的苹果酸脱氢酶可能被下调甚至失活，以有利于苹果酸硫激酶的活包括来自大肠杆菌的aceE和/或aceF。编码丙酮酸激酶的示例性基因包括来自大肠杆菌的本文提出的酶候选物的羧化活性将碳改路线从丙酮酸或磷酸烯醇丙酮酸到CO2[0052]本公开还提供使用本文所述的重组微生物生产GA和/或甘氨酸的方法。在一些实施方案中，使用本文所述的重组微生物生产乙醇酸和/或甘氨酸的方法包括在培养基中培[0054]本文还提供产生重组微生物的方法，所述重组微生物从乙醛酸生产乙醇酸和/或[0055]在一些实施方案中，产生生产乙醇酸和/或甘氨酸的重组微生物的方法包括向所化将苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；以及(c)编码催化将苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解[0056]在一些实施方案中，产生生产乙醇酸和/或甘氨酸的重组微生物的方法包括向所转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；(b)编码催化OAA转化成苹果酸的苹果酸脱氢化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中由苹果酰辅[0057]在一些实施方案中，产生生产乙醇酸和/或甘氨酸的重组微生物的方法包括向所[0059]在一些实施方案中，产生生产乙醇酸和/或甘氨酸的重组微生物的方法还可包括向所述微生物中引入：(a)编码催化乙醛酸转化成乙醇酸的NADH依赖性的乙醛酸还原酶的码丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的基因、编码甘氨酸脱氢酶的基因、编码甘氨酸转氨酶的基[0060]在一些实施方案中，产生生产乙醇酸和/或甘氨酸的重组微生物的方法还可包括[0061]在一些实施方案中，产生生产乙醇酸和/或甘氨酸的重组微生物的方法还可包括[0062]在一些实施方案中，产生生产乙醇酸和/或甘氨酸的重组微生物的方法还可包括[0063]在一些实施方案中，产生生产乙醇酸和/或甘氨酸的重组微生物的方法还可包括[0064]在一些实施方案中，产生生产乙醇酸和/或甘氨酸的重组微生物的方法还可包括向编码丙氨酸转氨酶的基因和/或编码NADPH依赖性谷氨酸合酶的基因中引入功能获得性[0069]图2表示共同利用已知的乙醇酸(GA)和甘氨酸(Gly)的生产途径和本公开的逆向[0070]图3是描绘从葡萄糖到GA的最大理论生产产率的通量图的示意图，其使用己糖激羧化酶(PYC)的羧化作用，并组合乙醛酸支路(GS)和逆向乙醛酸支路(rGS)。基于使用的[0071]图4是描绘从葡萄糖生产GA的最大理论生产产率的通量图的示意图，其使用磷酸[0074]如本文和所附权利要求中所使用，除非上下文另有明确规定，单数形式“一种品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括未明确列出的其它元素或此类组合物、混绿色非硫细菌(也是厌氧光养生物)；(10)抗辐射微球菌及其相关；(11)栖热袍菌(Thermotoga)和热虹吸管嗜热菌(Thermosiph[0081]术语“重组微生物(recombinantmicroorganism)”和“重组宿主细胞(recombinanthostcell)”在本文中可互换地使用以及指已经经过基因修饰用以表达或亚基的RNA分子或等效RNA分子的水平、或一种或多种多肽或多肽亚基的活性被上调或下或Northern杂交进行定量(参见Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))。可以通过各种方法定量由选择表示该微生物体或酶具有在参考物种中天然存在的菌株(包括参考物种的野生型菌株)中微生物或宿主细胞中，但在细胞中非天然位置产生或在细胞中以非天然的量产生；和/或(c)分子在核苷酸或氨基酸序列上与内源性核苷酸或氨基酸序列不同，使得与酸或氨基酸在核苷酸或氨基酸序列上不同的分子在细胞中以非天然的(例如，大于天然存在的)量产生。多核苷酸的异源表达可通过以下实现：将一种或多种包含目的基因的载体[0089]如果基因编码的氨基酸序列与第二个基因所编码的氨基酸序列具有相似的氨基或已知在功能上是相关的。功能关系可以通过多种方式中的任何一种来表示，包括但不限99.8％、或至少99.9％。可以使用本领域中容易获得的软件程序来确定同源性，例如在CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人，编，1987)增刊30，节国)和ALIGNPlus(ScientificandEducationalSoftware,宾夕法尼亚州)。其它非限制性比对程序包括Sequencher(GeneCodes,安娜堡，密歇根)、AlignX、和VectorNTI且很可能该特定途径被改进或被替换为更有效率低于最大产率(Dugar等人，“Relativepotentialofbiosyntheticpathwaysfor非天然代谢途径的NAD+/NADH和NADP+/NADPH的平衡。氧化还原状态反映在几组代谢物(例实施方案中，外部氢或电子源与能够将氢转化为NAD(P)H的氢化酶组合使用或不组合使用时，可能有益于增加具有负氧化还原平衡(即当氧化还原辅因子(例如NAD(P)H)短缺时)的[0096]美国专利号9,034,615中描述了使用乙醛酸支路(G该专利整体并入本文。该专利公开通过减弱乙醛酸消耗途径并增加NAD(P)H依赖性的乙醛PCT公开号WO2016/193540也公开乙醛酸支路途径用于生产乙醇酸的用途，这些专利全部对于每摩尔消耗的葡萄糖具有高度过量的4molNADH和2mol醌醇，所有这些都需要重新氧化才能使细胞存活。该途径的整体化学计量和产率潜力可概括如下：葡萄糖->2GA+2CO2+[0097]通过基于戊糖衍生物到乙醇醛的途径生产GA的描述见于PCT公开号WO2017/为来源的GA生产具有1.01g_GA/g_木糖的降低的产率潜力，而木糖→GA转化的热力学最大[0098]PCT公开号WO2015/181074(整体通过引用并入本文)公开了一种生产D-赤藓糖和耗的葡萄糖具有高度过量的2molNADH和1mol醌醇，所有这些都需要重新氧化才能使细胞[0100]所有这些途径生产过量的NADH和释放过量的CO2，即这些途径并没有达到热力学中，本发明的生产乙醛酸的重组微生物包括之前描述的用于生产GA和/或甘氨酸的代谢途述的单独途径(包括最近公布的使用木糖的高产率途径)更高的GA为止所描述的GA或甘氨酸生产途径都没有利酸支路途径从乙醛酸生产乙醇酸和/或甘氨酸。逆向乙醛酸支路途径的表达增加作为中间[0109]在一些实施方案中，本公开提供用于合成乙醇酸和/或甘氨酸的生产乙醛酸的重与OAA组合以增加GA和/或甘氨酸的生物[0110]在一些实施方案中，本公开提供用于合成乙醇酸和/或甘氨酸的生产乙醛酸的重酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因；(c)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中由苹果酰辅酶A裂解酶生产的乙酰辅酶A与磷酸葡萄糖异构酶活性，或更优选地不通过酶磷酸葡萄糖异构酶催化葡萄糖-6-磷酸向果果酸；将苹果酸转化为苹果酰辅酶A(CoA)以及将苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A。不催化苹果酸向丙酮酸的逆向反应或显示苹果酸向丙酮酸的转化降低。在一些实施方案磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因与编码苹果酸脱氢酶(该酶催化将OAA转化为苹果酸)的基因组合、编码将苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的为OAA的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；和/或编码催化将丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶基因；和/或编码催化将OAA转化为编码将苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因。在一个实施酸(PEP)和/或丙酮酸羧化为草酰乙酸(OAA)；将苹果酸转化为苹果酰辅酶A(辅酶A)以及将苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A；其中逆向乙醛酸支路途径不包括将OAA转化为苹转化为OAA的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中该微生物不包含编码催化将OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因，或者在编码催化将OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码将磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中该微生物不包含编码催化将OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因，或者在编码催化将OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因中[0116]逆向乙醛酸支路和其它途径生产的乙醛酸可以转化为乙醇酸和/或甘氨酸。为了增加GA的生产，本文公开的实施方案中的任一项的重组微生物可包含编码NAD(P)H依赖性的实施方案中的任一项的重组微生物可包含在编码NAD(P)H依赖性的乙醛酸还原酶的基因中的功能获得性突变，以使得NAD(P)H依赖性的乙醛酸还原酶活性与缺少该突变的微生物中的任一项的重组微生物可包含在一种或多种上述编码生产甘氨酸的酶的基因中的功能化苹果酸转化为丙酮酸或将苹果酸转化为OAA的逆反应，或催化该逆反应但具有降低的效于埃希氏杆菌(例如，来自大肠杆菌的基因mqo)、假单胞菌(例如，来自恶臭假单胞菌(P.putida)的基因mqo)或芽孢过琥珀酰辅酶A连接酶活性(也称为琥珀酰辅酶A合成酶)将苹果酸转化成苹果酰辅酶A。在来自细菌，例如埃希氏杆菌(例如，来自大肠杆菌的基因sucCD-2)、嗜热栖热菌(Thermus因mtkAB或sucCD)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、热自养甲烷热杆菌(Methanothermobacterthermautotrophicus)、假单胞菌、甲基球菌属(Methylococcus日本根瘤菌(Mesorhizobiumjaponicum)、食腐菌生丝微菌(Hyphomicrobiummethylovorum)、反硝化生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)、荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)、红细菌科细菌(Rhodobacteraceaebacterium)或根瘤菌[0125]苹果酰辅酶A被苹果酰辅酶A裂解酶转化为乙醛酸和乙酰辅酶A。在一个实施方案案中，编码苹果酰辅酶A裂解酶的基因来自于甲基杆菌(例如，来自扭脱甲基杆菌的基因mclA)、扭脱甲基杆菌、Thalassobiusactivus、红细菌(例如来自类球红细菌分枝杆菌((例如，来自耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)的基因mcl1)、食腐菌生丝微菌(Hyphomicrobiummethylovorum)、玫瑰杆菌(Roseobacter)(例如，海滨玫瑰杆菌(R.litoralis)的基因mcl1)、欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseuropaea)、杀虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)、绿丝菌(Chloroflexus)(例如，来自嗜热光全绿丝菌[0126]由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶将PEP羧化为草酰乙酸。在一(Saccharumhybrid)、大豆(glycine)(例如来自大豆(G.max)的基因ppc)、红花烟草(Nicotianatabacum)、籽粒苋(Amaranthushypochondriacus)、普通小麦(Triticum菌(S.bovis)的基因pck或pckA)、瘤胃球菌(Ruminococcus)(例如，来自白色瘤胃球菌(R.albus)和黄色瘤胃球菌(R.flavefaciens)的基因pck或pckA)、放线杆菌菌、热纤瘤胃梭状芽孢杆菌(Ruminiclostridiumthermocellum)、克雷伯氏菌光滑念珠菌(C.glabrata)的基因pyc1)、贪铜菌(Cupriavidus)(例如，来自杀虫贪铜菌棒状杆菌(Corynebacterium)(例如，来自嗜甘氨酸棒状杆菌(C.glyciniphilum)的基因pyc)、诺卡氏菌(例如，来自新星诺卡氏菌(N.nova)的基因pyc1)；或酵母，例如酵母[0128]NADH乙醛酸还原酶或NADPH乙醛酸还原酶可将乙醛酸还原生产乙醇酸。在一个实[0129]在一个实施方案中，可以通过共同利用rGS途径与乙醛酸支路(GS)途径而增加乙由苹果酰辅酶A裂解酶对苹果酰辅酶A的活性生产的乙酰辅酶A)可以重新并入代谢途径以酰辅酶A可以转化为乙醛酸和乙酰辅酶A(苹果酰辅酶A裂解酶)；乙酰辅酶A可与OAA组合形为异柠檬酸(D-苏式异柠檬酸水解酶或顺乌头酸酶)；异柠檬酸可转化为琥珀酸和乙醛酸酸可转化为琥珀酸和乙醛酸(异柠檬酸裂解酶)；琥珀酸可以转化为延胡索酸(琥珀酸脱氢一个实施方案中，该重组微生物包含(a)编码将乙酰辅酶A和OAA转化为柠檬酸的柠檬酸合转化为异柠檬酸的D-苏式异柠檬酸水解酶或顺乌头酸酶的基因；(d)编码将异柠檬酸转化为琥珀酸和乙醛酸的异柠檬酸裂解酶的基因；(e)编码将琥珀酸转化为延胡索酸的琥珀酸性实施方案中，可根据本公开失活的编码苹果酸合酶的基因包括大肠杆菌中的aceB和/或的通量比率(fluxratio)以获得对应动子cI或本领域普通技术人员已知的其它启动子。也可以通过稳定相应信使RNA的元件(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15,58-64)或蛋白质(例如，GST标签，AmershamBiosciences)来增强基[0137]在一个实施方案中，重组微生物中的内源性乙醛酸支路(GS)途径和/或其它中心方案中，可以修饰包含rGS途径的重组微生物以删除或减弱至少一种编码选自以下的酶的[0138](a)苹果酸合酶(例如，大肠杆菌中的基因aceB和/或glcB或酿酒酵母中的基因[0139](b)异柠檬酸脱氢酶(例如，大肠杆菌中的基因icd或酿酒酵母中的基因IDP2和[0142]在一些实施方案中，可以删除或减弱包含rGS途径的重组微生物中的内源乙醛酸[0158](c)删除或减弱编码丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶的基[0159](d)删除或减弱编码苹果酸脱氢酶的基因，所述苹果酸脱氢酶催化草酰乙酸转化[0180](c)删除或减弱编码丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶的基[0181](d)删除或减弱编码苹果酸脱氢酶的基因，所述苹果酸脱氢酶催化草酰乙酸转化案中，使用rGS途径和/或在上述一种或多种基因中的修饰生产的乙醇酸的总化学计量是：葡萄糖+2CO2+2NAD(P)H+2ATP-状态的不平衡(例如细胞内汇集(pool)的NADPH和NADH辅因子的不平衡、不平衡的净ATP、增加NADPH依赖性的乙醛酸还原酶的活性以促进乙醛酸肠杆菌中的基因yfjB)来增加细胞内NADH或NADPH的浓度，已经描述在US20140335578,Cui等人，MicrobialCellFactories2014,13:21,和Shi等人，MetabolicEngineering16半胱氨酸(cystein))和/或氢添加到培养基中作为额外的还原动力源以调节代谢途径中的于戊糖衍生物到乙醇醛的途径描述见于PCT公开号WO2017/059236和WO2016/79440和美国授权前公开号US2016/0076061和US2015/0147794。所有这些途径生成过量的NADH和释[0198]葡萄糖->2GA+2CO2+4NADH+2醌醇+2ATP；y＝0.84g/g，Y(max)＝1.70g/g，y是Y[0203]通过将上述途径与本发明的rGS途径组合或共利用，GA的产率可以显著增加。例专利号8,911,978中描述的基于丝氨酸/羟基丙酮酸的途径产生的NADH和CO2。在另一个实径描述见美国专利号9,034,615和8,945,888、PCT公开号WO2016/193540和美国授权前公衍生物到乙醇醛的途径产生的NADH和CO2，其描述见于PCT公开号WO2015/181074、WO氧化戊二酸中来补充谷氨酸自身，这需要NAD(P)H谷氨酸合酶(EC3、EC案中的重组微生物可包含一种或多种选自以下基因：编码丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶(EC4)的基因、编码甘氨酸脱氢酶(E.C.0)的基因、编码甘氨酸转氨酶酸氧化酶(E.C.9)的枝杆菌属(例如，结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌)、假单胞菌属、红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、乳杆菌属(Lactobacillussp.)、氢杆菌属[0229]葡萄糖+10/3NH3+2/3CO2+2/3ATP->10/3甘氨酸+2醌醇；y＝1.06g/g(葡萄糖+10/[0234]在一个实施方案中，增加在包含rGS途径的重组微生物中的至少一种基因的表达[0246]在某些实施方案中，包含逆向乙醛酸支路途径的重组微生物利用由其它乙醇酸和/或甘氨酸生成途径和/或外源提供的其它碳源(CO2和/或HCO3-和/或其它碳酸)生成的[0248]包含rGS途径的重组微生物可具有降低的或去除的木酮糖激酶活性，或者降低的微生物可能具有降低的或去除的将木糖相互转化为D-木酮糖的酶(例如，来自大肠杆菌的基因xylA)的活性、或所述酶的降低的或去除的表达，重组表达将木糖转化为D-木糖酸的酶，重组表达将D-木糖酸转化为2-脱氢-3-脱氧-D-戊酸(2-dehydro-3-deoxy-D-醛缩酶(例如来自大肠杆菌的基因yagE)，以及重组地表达乙醇醛脱氢酶，例如醛脱氢酶A酶是D-塔格糖3-差向异构酶(例如，来自菊苣假单胞菌(Pseudomonascichorii)的基因果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因、和编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的氢酶催化丙酮酸转化为苹果酸和/或催化OAA转化为苹果酸，但优选不催化(或催化效率较酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因，组合编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因、以及编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因，组合编码催化苹果酸转化为苹果酰辅酶A的苹果酸硫激酶的基因、以及编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因、和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA优选不催化(或催化效率较低)从苹果酸到丙酮酸或从苹果酸酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因、和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；编码催化丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基A的苹果酸硫激酶的基因；以及编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因、和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为的基因，以及编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基码催化将OAA转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因中包含删除或功能酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因、和/或编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化为OAA的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的基因；编码催化丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基因，其中该微生物不包含编码催化[0261]在一个实施方案中，乙醛酸被重组微生物表达的NAD(P)H依赖性的乙醛酸还原酶[0263]在本公开的方法中使用的合适的培养基包含可发酵的碳[0264]在另一个实施方案中，用于生产GA和/或甘氨酸的方法包括在合适的培养基中培[0272](c)删除或减弱编码丙酮酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶和/或丙酮酸甲酸裂解酶的基[0273](d)删除或减弱编码催化草酰乙酸转化成苹果酸、或苹果酸转化成草酰乙酸的苹[0275]在另一个实施方案中，用于生产GA和/或甘氨酸的方法包括在合适的培养基中培[0280](a)减弱编码催化草酰乙酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基因、或催化苹果酸转化为草酰乙酸的苹果酸脱氢酶的基因，或减弱/突变编码催化丙酮酸羧化为苹果酸的苹[0282]在另一个实施方案中，用于生产GA和/或甘氨酸的方法包括在合适的培养基中培[0292](d)删除或减弱编码催化苹果酸转化成丙酮酸的苹果酸脱氢酶的基因，或删除或减弱编码催化苹果酸转化成草酰乙酸的苹果酸脱[0299]在又一个实施方案中，用于生产GA和/或甘氨酸的方法包括在合适的培养基中培养重组微生物，所述重组微生物表现出一种或多种酶的增加的表达水平、或增加的活性[0300]在另一些实施方案中，用于生产GA和/或甘氨酸的方法包括在合适的培养基中培[0303]本公开的方法可以提供在每克碳源约1.1g乙醇酸至约2.0g/g范围内的乙醇酸的[0304]本公开的方法可以提供在每克碳源约1.0g甘氨酸至约1.5g/g范围内的甘氨酸的[0306]本公开还包括生产聚乙醇酸(PGA)的方法。本公开的重组微生物生产的乙醇酸可任一实施方案中的重组微生物可包含编码聚羟基烷酸酯(polyhy[0308]已知四种主要的PHA合酶类别(Rhem,B.,2003)。菌(Ralstoniaeutropha)中)优先利用包含3至5个碳原子的各种羟基脂肪酸的辅酶A-硫至14个碳原子的各种羟基脂肪酸的辅酶A-硫酯。III类合酶(例如，在葡萄异色菌[0312]如果不通过体内聚合，本领域已知有化学聚合方法：具有高分子量PGA的来自直接缩聚产生PGA以获得低分子量的PGA(Singh&Tiwari，InternationalJournalof[0318](d)编码将OAA转化为苹果酸和/或将丙酮酸转化为苹果酸的苹果酸脱氢酶的基[0323]编码上述多肽的基因的核苷酸序列是本领域已知的并且是可公开获得的ycdW(编码NADPH依赖性的乙醛酸还原酶过将导致酶活性减少的突变引入基因中而减[0325]在一些实施方案中，用于生产重组微生物的方法包括向微生物中引入删除或修[0337]用于生产重组微生物的方法还可包括(a)将减弱编码苹果酸：醌醇氧化还原酶的于上文所述的基本特征以及所附权利要求的范围[0342]计算机模拟分析通过大肠杆菌中的逆向乙醛酸支路活性生物合成和改善的乙醇[0343]进行通量平衡分析(FBA)以模拟在各种情况下本文所述的基因修饰对乙醇酸的生谢模型iJO1366(OrthJD.等人(2011)Acomprehensivegenome-scalereconstruction用乙醛酸(GS)和逆向乙醛酸(rGS)支路组合的乙醇酸(GA)生产。修饰该模型以包括其它反应和相应的代谢物，包括苹果酸硫激酶反应(EC)、苹果酰辅酶A连接酶反应(EC[0344]使用OptFlux软件(RochaL.(2010)OptFlux:anopen-sourcesoftware酶系统(PTS)，而用于进入TCA循环的羧化酶是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)[0345]通过应用在大肠杆菌菌株体内培养条件下容易重现的一组限制(constraint)来进行模拟，其中葡萄糖是碳底物以及在有氧条件下。葡萄糖底物通量任意设定为10μ[0350]通过将大肠杆菌中的逆向乙醛酸支路活性与通过丙酮酸羧化酶活性的羧化作用[0351]如前所述(AlkimC.(2016)thesyntheticxylulose-1phosphatepathway由gcl(GenBankGeneID：945394)编码的乙醛酸醛连接酶、和由eda(GenBankGeneID:xylulose-1phosphatepathwayincreasesproductionofglycolicacidfromxylose-richsugarmixtures.BiotechnolB[0354]为了构建具有增强的戊糖磷酸活性和NADPH汇集的菌株，根据标准程序通过CRISPR-Cas9(JiangY.等人(2015)MultigeneeditingintheEscherichiacoligenomeviatheCRISPR-Cas9system.ApplEnvironMicrobiol,81:2506-2514)来删除cas9ParaB-RedlacIqPtrc-sgRNA-pMB1)是从AddGene(分别为Addgene质粒#62226和#[0355]使用在表2中描述的引物Pgi_N20_FW和Pgi_N20_RV通过重叠PCR获得pTargetF[0358]通过调整来自(JiangY.等人(2015)MultigeneeditingintheEscherichiacoligenomeviatheCRISPR-Cas9system.ApplEnvironMicrobiol,81:2506-2514)的操作方案进行基因组编辑。首先使用标准程序(WoodallCA.(2003)PlasmidVectors.MethodsinMolecularBiology.235)通过电穿孔使用pCAS质粒转化菌株SGK_导λ-Red重组酶，如之前所述(JiangY.等人(2015)MultigeneeditingintheEscherichiacoligenomeviatheCRISPR-Cas9system.ApplEnvironMicrobiol,81:[0360]根据标准程序(ThomassonLC.(2007)E.coliGenomeManipulationby等人(2006)ConstructionofEscherichiacoliK-12in-frame,single-geneknockoutmutants:theKeiocollection.MolSystBiol.2:2006.0008)中获得的MG1655Δpgi::区域的特异性重组进一步去除抗生素标志物，如之前在文献(DatsenkoKA.等人(2000)One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.ProcNatlAcadSciUSA.97(12):6640-5)中所述。所得的菌株称为SGK_rGS_MG1655的基因组中通过PCR扩增天然异柠檬酸裂解酶aceA(SEQIDID:948517)和乙醛酸还原酶ghrA(SEQIDNO:23)(GeneBankTrichez等人所述(TrichezD.(2018)EngineeringofEscherichiacoliforKrebs粒pACT3w-ppcK620S-gltAR163L中回收NADH不敏感型柠檬酸合酶突变体gltAR163L(SEQIDNO:[0363]为表达这些作为合成的操纵子的基因，首先用J23119组成型启动子(SEQIDNO:19)(/Promoters/Catalog/Anderson)替代PA1lacO-1的J23119启动子作为合成的基因片段。随后，通过限制性克隆将其克隆到pZS13-Luc质粒中，克隆在限制性位点AatII和KpnI之间。通过用KpnI和AvrII消化从pZA21-MCS质粒[0364]使用表3中描述的引物通过PCR扩增所有基因。根据制造商的操作方案，使用EZ-造商的操作方案，通过使用NEBuilderHiFiDNAAssemblyCloningKit(NewEnglandBiolabs)，将纯化的片段克隆到通过KpnI和HindIII的限制性消化进行线性化的pZS1-J23119-MCS质粒中。通过PCR和测序确认构建。所得合成的操纵子称为J23119-pyc-aceA-域加下划线。使用NEBuilder@HiFiDNAAssemblyCloningKitHiFiDNAAssemblyCloningKit(NewEnglandBiolabs)用突出端来组装克[0370]来自荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)菌株Bath的编码苹果酸硫激酶的sucC2-sucD2操纵子(SEQIDNO:26)(Uniprot菌(Methylobacteriumextorquens)AM1的编码苹果酰辅酶A裂解代PLtetO-1启动子从而对pZS13-MCS质粒(Expressys)进行修饰，然后通过限制性位点AatII[0371]使用表4中描述的引物通过PCR扩增所有基因。根据制造商的操作方案，使用EZ-Biolabs)，将纯化的片段作为合成的操纵子克隆到通过EcoRI和MluI的限制性消化进行线程化的菌株SGK_rGS_01和SGK_rGS_02。使用标准程序(WoodallCA.(2003)PlasmidVectors.MethodsinMolecularBiology.235)通过电穿孔使用相应的质粒转化所有菌[0376]菌株在补充有15mM乙酸和1g/L酪蛋白氨基酸的M9葡萄糖介质(20g/L葡萄糖)中生用RezexROA-OrganicAcid柱(Phenomenex)在80℃下使用H2SO40.5mM作为流动相(0.5mL/[0377]如表6所示，在没有质粒或只有质粒pZS1-pyc或pZA3-RGS的MG1655野生型对照菌径(即乙醛酸和乙醇酸降解途径)仍然有活性。有趣的是，当在MG1655野生型菌株中表达径的组合即使在野生型菌株中对GA的生产也具有积极[0383]通过将大肠杆菌中的逆向乙醛酸支路活性与通过pep羧化酶活性中的羧化作用组[0384]下述实验在大肠杆菌K12菌株MG1655ΔaceBΔglcDEFGBΔgclΔedd-eda中进行。该菌株称为SGK_rGS_00，是Alkim等人的礼物(AlkimC.等人(2016)TheSyntheticXylulose-1phosphatepathwayincreasesproductionofglycolicacidfromxylose-richsugarmixtures.Biotechno等人(2015)MultigeneeditingintheEscherichiacoligenomeviatheCRISPR-Cas9system.ApplEnvironMicrobiol,81:2506-2514)通过CRISPR-Cas9删除编码葡萄[0388]使用从Keio单基因删除合集(BabaT.等人(2006)ConstructionofEscherichiacoliK-12in-frame,single-geneknockoutmutants:theKeiocollection.MolSystBiol.2:2006.0008)中获得的MG1655Δpgi::KanR菌株JW1666，根据标准程序进行转导(ThomassonLC.(2007)E.coliGenomeManipulationbyP1Transduction.CurrProtocMolBiol.79:1.17)，在菌株SGK_rGS_01中删除丙酮酸激酶IpykF(GenBankGeneID:素标志物(DatsenkoKA.等人(2000)One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.ProcNatlAcadSciUSA.97(12):6640-[0390]质粒pACT3w-ppcK620S-gltAR163L获自Trichez等人(TrichezD.(2018)EngineeringofEscherichiacoliforKrebscycle-dependentproducCellFact.17:113)。所述质粒包含在诱导型PTac启动子控制下的苹果酸不敏感的pep羧化酶突变体ppcK620S和NADH不敏感的柠檬FW/ghrA_RV，从大肠杆菌MG1655的基因组中通过PCR扩增编码天然异柠檬酸裂解酶aceA的基因(GeneBankGeneID:948517)和编码乙醛酸还原酶ghrA的基因(GeneBankGeneID:区域加下划线。使用HiFiDNAAssemblyCloningKit(NewEngland[0393]根据制造商的操作方案，使用EZ-10SpinColumnDNAGelExtractionKit[0395]如实施例2中所述，来自荚膜甲基球菌菌株Bath的编码苹果酸硫激酶的sucC2-pZA3-rGS。为在与质粒pACT3-ppc兼容的背景中表达PTac-sucCD-mcl，通过在限制性位点AvrII和BglII之间的限制性克隆，将PTac-sucCD-mcl进一步转移到pZE23-MCS质粒程序(WoodallCA.(2003)PlasmidVectors.MethodsinMolecularBiology.235)通过电[0400]菌株在补充有15mM乙酸和1g/L酪蛋白氨基酸的M9葡萄糖介质(20g/L葡萄糖)中生长约50小时。添加氯霉素和卡那霉素使得终浓度分别为25μg/mL和50μg/mL(即，对于携带RezexROA-OrganicAcid柱(Phenomenex)在80℃下使用H2SO40.5mM作为流动相(0.5mL/分与表达pACT3-ppc的菌株相比显示出525％的改善，与表达两种质粒的野生型菌株相[0408](c)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基[0410](a)编码催化丙酮酸转化为草酰乙酸(OAA)的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催[0413](d)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基[0415](a)编码催化丙酮酸转化为草酰乙酸(OAA)的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催[0417](c)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基[0418]4.任一前述实施方案中的重组微生物[0419]5.任一前述实施方案中的重组微酶A与OAA组合以增加GA和/或甘氨酸的生物为乙醇酸的NADH依赖性的乙醛酸还原酶的基因、或编码催化乙醛酸转化为乙醇酸的NADPH[0422]8.任一前述实施方案中的重组微生物[0424]10.任一前述实施方案中的重组微生物酸脱氢酶来自酶分类(E.C.)1.1.[0425]11.任一前述实施方案中的重组微生[0428]14.任一前述实施方案中的重组[0429]15.任一前述实施方案中的重组微生物，其中所述基因mdh来自天蓝色链霉菌[0430]16.任一前述实施方或假单孢菌(Pseudomonas)的sucCD和/或SucCD-2和/或mtkAB自扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、类球红细菌(Rhodobacter海滨玫瑰杆菌(Roseobacterlitoralis)、反硝化生丝微菌(Hyphomicrobiumdenitrificans)、类球红细菌、耻垢分歧杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)或带化红球菌(Rhodococcusfascians)的mcl和/或Mcl1和/或mclA或其[0432]18.任一前述实施方案中的重组微生豆根瘤菌(Rhizobiumetli)的pyc、来自酵母的PYC1或PYC2、或来自枯草芽孢杆菌[0433]19.任一前述实施方案中的重组微生物ppc1/2/3、来自大豆(G.max)的ppc、或者是来自红嗜热盐菌(Rhodothermus)、棒状杆菌(Corynebacterium)、沙门氏菌(Salmonella)、生丝微菌(Hyphomicrobium)、链球菌草(Nicotianatabacum)、籽粒苋(Amaranthushypochondriacus)、普通小麦(Triticum[0434]20.任一前述实施方案中的重组微生自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)的pckA、来自克雷伯氏菌属(Klebsiella和黄瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)的pck或pckA、来自产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)的pckA、来自牛链球菌(Streptococcusbovis)的pck或[0436](a)编码柠檬酸合酶的基因，所述柠檬酸合酶将苹果酰辅酶A裂解酶产生的OAA和[0438](c)编码将顺乌头酸转化为异柠檬酸的D-苏式异柠檬酸水解酶或顺乌头酸酶的基[0442]22.任一前述实施方案中的重组微(Thermococcuslitoralis)的gyaR和/或来自拟南芥(A.thalianaE.C.2和E.C.4.1.或将苹果酰辅酶A转化成乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶来自E.C.4或[0452]28.任一前述实施方案中[0453]29.任一前述实施方案中的重组微生物，[0454]30.任一前述实施方案中的重组微[0456]32.任一前述实施方案中的重组微生[0463]35.任一前述实施方案中的重组微生物码NADPH依赖性谷氨酸合酶的基因的表[0484]56.一种使用任一前述实施方案中的重组微生物生产乙醇其中所述方法包括在含有提供碳源的原料的培养基中培养重组微生物直到生产出乙醇酸[0489]61.任一前述实施方案中的方法[0495](c)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基[0497](a)编码催化丙酮酸转化为OAA的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催化磷酸烯醇[0501](d)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基[0503](a)编码催化丙酮酸转化为草酰乙酸(OAA)的丙酮酸羧化酶的基因，和/或编码催[0505](c)编码催化苹果酰辅酶A转化为乙醛酸和乙酰辅酶A的苹果酰辅酶A裂解酶的基[0506]67.任一前述实施方案中的方法[0511]69.任一前述实施方案中的方法，其包[0523]72.任一前述实施方案中的方法，其包括向编码丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的基酸转化为甘氨酸的甘氨酸氧化酶的基因中引入功能获[0524]73.任一前述实施方案中的方法，其包括向编码丙氨酸转氨酶的基因和/或编码NADPH依赖性谷氨酸合酶的基因中引入功能获得[0002]<110>布拉斯科公司[0003]<120>通过逆向乙醛酸支路生产乙醇酸和甘氨酸的微生物和方法[0004]<130>BRSK-010/02WO(331051-2041)[0005]<150>62/806,195[0006]<151>2019-02-15[0008]<170>PatentInversion3.5[0012]<213>人工序列[0014]<223>引物Pgi_N20_FW[0016]gtcctaggtataatactagtccgattatctggggtgaaccgttttagagctagaaatagc60[0020]<213>人工序列[0022]<223>引物Pgi_N20_RV[0024]actagtattatacctaggactgag24[0028]<213>人工序列[0030]<223>Pgi_H1_FW[0032]atgaaaaacatcaatccaacgc22[0036]<213>人工序列[0038]<223>引物Pgi_H1_RV[0040]ggtggatcagtcggtcaccatgtatgggc29[0044]<213>人工序列[0046]<223>Pgi_H2_FW[0048]tggtgaccgactgatccaccagggaacca29[0052]<213>人工序列[0054]<223>引物Pgi_H2_RV[0056]catatcgacgatgattaaccgc22[0060]<213>人工序列[0064]ttgtttaactttaaggaggtttggaggtaccatgcccatatccaag46[0068]<213>人工序列[0072]ttttcatacggttcctccttctagatcatccgccgtaaaccg42[0076]<213>人工序列[0078]<223>引物aceA_[0080]cggatgatctagaaggaggaaccgtatgaaaacccgtacacaacaaat48[0084]<213>人工序列[0086]<223>引物aceA_RV[0088]ttgtatcagccatcgtgtgcctcctttagaactgcgattcttcagtg47[0092]<213>人工序列[0094]<223>引物gltA_[0096]atcgcagttctaaaggaggcacacgatggctgatacaaaagcaaaactc49[0100]<213>人工序列[0102]<223>引物gltA_RV[0104]agatgatatccatcgtgtgcctcctttaacgcttgatatcgcttttaaagtc52[0108]<213>人工序列[0110]<223>引物ghrA_[0112]tatcaagcgttaaaggaggcacacgatggatatcatcttttatcacccaac51[0116]<213>人工序列[0118]<223>引物ghrA_RV[0120]ggctgcaggaattcgatatcatagattagtagccgcgtgcgcg43[0124]<213>人工序列[0126]<223>引物sucCD_FW[0128]acaatttcacacaggaaacagaattcctataattttgtttaactttaag49[0132]<213>人工序列[0134]<223>引物sucCD_RV[0136]tatagtctagatcagaatctgattccgtg29[0140]<213>人工序列[0144]gaatcagattctgatctagactataattttgtttaactttaaggaggtt49[0148]<213>人工序列[0152]tagcacgcgtttactttccgcccatcgcg29[0156]<213>人工序列[0158]<223>J23119启动子[0160]gacgtccacagctaacaccacgtcgtccctatctgctgccctaggtctatgagtggttgc60[0161]tggataacttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagctaatagaaataattttg120[0162]tttaactttaaggaggtttggaggtacc148[0166]<213>菜豆根瘤菌pycatgcccatatccaagatactcgttgccaatcgctctgaaatagccatccgcgtgttccgcgcggccaacgagcttggaataaaaacggtggcgatctgggcggaagaggacaagctggcgctgcaccgcttcaaggcggacgagagttatcaggtcggccgcggaccgcatcttgcccgcgacctcgggccgatcgaaagctatctgtcgatcgacgaggtgatccgcgtcgccaagctt240tccggtgccgacgccatccatccgggctacggcctcttgtcggaaagccccgaattcgtcgatgcctgcaacaaggccggcatcatcttcatcggcccgaaggccgatacgatgcgccagcttggcaacaaggtcgcagcgcgcaacctggcgatctcggtcggcgtaccggtcgtgccg420gcgaccgagccactgccggacgatatggccgaagtggcgaagatggcggcggcgatcggc480tatcccgtcatgctgaaggcatcctggggcggcggcggtcgcggcatgcgcgtcattcgttccgaggccgacctcgccaaggaagtgacggaagccaagcgcgaggcgatggcggccttc600ggcaaggacgaggtctatctcgaaaaactggtcgagcgcgcccgccacgtcgaaagccag660atcctcggcgacacccacggcaatgtcgtgcatctcttcgagcgcgactgttccgttcagcgccgcaatcagaaggtcgtcgagcgcgcgcccgcaccctatctttcggaagcgcagcgccaggaactcgccgcctattcgctgaagatcgcaggggcgaccaactatatcggcgccggc840accgtcgaatatctgatggatgccgataccggcaaattttacttcatcgaagtcaatccg900cgcatccaggtcgagcacacggtgaccgaagtcgtcaccggcatcgatatcgtcaaggcg960cagatccacatcctggacggcgccgcgatcggcacgccgcaatccggcgtgccgaaccaggaagacatccgtctcaacggtcacgccctgcagtgccgcgtgacgacggaagatccggagcacaacttcattccggattacggccgcatcaccgcctatcgctcggcttccggcttcggcatccggcttgacggcggcacctcttattccggcgccatcatcacccgctattacgatccgctgctcgtcaaggtcacggcctgggcgccgaacccgctggaagccatttcccgcatggaccgggcgctgcgcgaattccgcatccgtggcgtcgccaccaacctgaccttcctcgaagcgatcatcggccatccgaaattccgcgacaacagctacaccacccgcttcatcgacacgacgccggagctcttccagcaggtcaagcgccaggaccgcgcgacgaagcttctgacctatctcgccgacgtcaccgtcaatggccatcccgaggccaaggacaggccgaagcccctcgagaatgccgccaggccggtggtgccctatgccaatggcaacggggtgaaggacggcaccaagcagctgctcgatacgctcggcccgaaaaaattcggcgaatggatgcgcaatgagaagcgcgtgcttctgaccgacaccacgatgcgcgacggccaccagtcgctgctcgcaacccgcatgcgtacctatgacatcgccaggatcgccggcacctattcgcatgcgctgccgaacctcttgtcgctcgaatgctggggcggcgccaccttcgacgtctcgatgcgcttcctcaccgaagatccgtgggagcggctggcgctgatccgagagggggcgccgaacctgctcctgcagatgctgctgcgcggcgccaatggcgtcggttacaccaactatcccgacaatgtcgt