CN113748341B 使用耳垢测定皮质醇和葡萄糖平均浓度的方法 （特雷尔斯有限公司）

2020.07.28PCT/IB2018/0604702018.12.20WO2019/123392EN2019.06.27EP0184237A1,1986.06.11WO2015083161A1,2015.06.11exposureandhormoneprofile要.exposureandhormoneprofiles.PNAS.2013,使用耳垢测定皮质醇和葡萄糖平均浓度的一种在耳垢中测量葡萄糖和皮质醇水平的2按照测量方法准备耳垢样本以测量皮质醇和葡萄糖水使用任何已知的手段或方法测量皮质醇和葡萄糖，其中将皮b)称量干燥耳垢样本的重量，以通过干重来标准化皮d)将步骤c)中获得的溶液分为第一溶液部分和第二溶液部分，f)在至少一分钟内搅拌装有步骤e)获得的溶液的试管，g)在至少两个小时内，将步骤g)中获得的混合溶液在-18保液体部分被冷冻并且不污染有机部分，该步骤提取那些明确溶解在二乙醚中的化合物，m)在至少一分钟内搅拌装有步骤I)所得溶液的试管，获得的溶液在重悬后向其加入n)在至少两个小时内，将步骤m)获得的混合溶液在-18至-213q)将步骤i)中获得的干燥部分储存在-20至-90℃之间的温度下a)使用制造商提供的缓冲液分析法对提取的样本进行重构，该方法使用比色竞争b)使用测量皮质醇的标准曲线-酶标仪NovoStar来c)使用荧光技术将耳垢的干重归一化，其中荧光计在530-570nm范围内激发，在590-2.根据权利要求1所述的测量耳垢中葡萄糖和皮质醇水平的方法，100g的耳垢使用3.根据权利要求1所述的测量耳垢中葡萄糖和皮质醇水平的方法，所述亲水性溶剂为4.根据权利要求1所述的测量耳垢中葡萄糖和皮质醇水平的方法，所述化合物是皮质8.根据权利要求1所述的测量耳垢中葡萄糖和皮质醇水平的方法，在步骤a)中通过使4样本的制备是通过将PBS缓冲溶液添加到试管中进行的；将海绵与其塑料支撑物分开溶解的耳垢溶液中，皮质醇水平通过ELISA技术测量，葡萄糖水平通过使用所述试剂20.根据权利要求1所述的测量耳垢中葡萄糖和皮21.根据权利要求1所述的测量耳垢中葡萄糖和皮22.根据权利要求1所述的测量耳垢中葡萄糖和皮23.根据权利要求1所述的测量耳垢中葡萄糖和皮24.根据权利要求1所述的测量耳垢中葡萄糖和皮25.根据权利要求1所述的测量耳垢中葡萄糖和皮5大的局限性。这是因为葡萄糖水平在白天变化很大，而且白天时发生的一些压力事件正相关，所以通常被用作反映葡萄糖长期平均水平的指标(Monnier等，2006；Bonora等，患者相比，健康人的餐后葡萄糖或空腹葡萄糖水平与HbA1c相关性较弱(van/tRiet等，差的糖尿病患者中，空腹葡萄糖水平与HbA1C的关联比餐后葡萄糖水平与其的关联强6以反映最近三个月的葡萄糖平均浓度，但其受最近一个月的血浆葡萄糖浓度的影响最大还受几个典型变量影响，例如食物摄入(Gibson&Checkley，1999)，尼古丁(Steptoe&[0018]不久前，头发样本被开始用作衡量皮质醇平均浓度水平的指标(Dettenborn等，效性的研究都是通过将毛发皮质醇浓度(HCC)与单个或几个皮质醇试样进行比较而进行，7那些将HCC与24小时尿液收集相关联的研究则显示出多样的结果。Sauvé等人(2007)发现类固醇沉积在毛囊内，因此未来的无发部分也依赖于反映头发生长周期的局部代谢变量部切除角质化组织，因为在该区域观察到的头发生长变异性较小(Pragst&Balikova，类型的脱发(IV型)影响40％40岁以上的男性和10％40岁以上的女性(Hamilton，1951年)，这还不包括很大一部分因头发没有达到最低长度而无法提供试样的人(至少一个厘米以反排除了由外部因素(例如紫外线辐射或使用清洁产品)在靠近发根四厘米以下部分引起的Ⅱ8签的流行不仅可以解释瘙痒感的普遍增加，而且还可以解释其被滥用的原因(Mochizuki研究发现，2011年至2017年期间，其销售额的增长率在美国为30中国为32欧洲为效且安全的替代设备需要被研发出来以替代风险[0030]很少有生物试样可以反映葡萄糖和皮质醇的平均水平。脂肪组织可能是其中之9尚不清楚这种独特的试样是否能够长期积累这[0034]本发明所用的方法经过系统评估，初步的研究也证实了耳垢分析的效率和可靠特殊磨蚀性和吸收性的纤维素海绵是从猪皮上去除人[0059]本说明将根据优选的实施例来描述本发明在耳垢中测量长期葡萄糖和皮质醇水[0075]g)在至少两个小时内，将步骤g)中获得的混合溶液在-18至-21℃(最好是-20℃)[0082]n)在至少两个小时内，将步骤m)中获得的混合溶液在-18至-21℃(最好在-20℃)[0086]r)在第三个试管中(不加均质溶液)将0.5ml的300pg/ml纯化的皮质醇溶液在pH值[0090]a)使用制造商提供的缓冲液对提取的样本进行重构，该方法使用比色竞争ELISA[0092]c)使用荧光技术将耳垢的干重归一化，其中荧光计在530-570nm范围内激发，在[0094]使用一部分先前溶解在PBS中用以测量皮质醇水平的耳垢溶液来测量葡萄糖水[0095]a)按照制造商的说明，使用KitSERA-PAKPLUS(BayerHealthCare)技术来测量均值获得葡萄糖浓度(mg/dl)，并根据归一化后样本的初始重量计算溶解在溶液中的葡萄[0105]海绵(8)被包好并在湿润状态下密封以使其保持柔软。所用的润湿剂为氯化镁[0107]在本发明的第二实施例中，通过将500μl的PBS缓冲溶液添加到5ml试管中来进行通过使用KitSERA-PAKPLUS(BayerHealthCare)试剂盒测量溶解的耳垢溶液中葡萄糖的提取方案。[0116]表II.1.初步研究-对来自五名志愿者(志愿者0析5.16pg./ml，对应三个试管的皮质醇浓度的平均值(289.2pg./ml、273.42pg./ml和的匀浆溶液中添加300pg纯化的皮质醇(参见方法)。进行此步骤是为了确定耳垢成分是否[0123]该过程还通过使用先前项目的三个血清样本作为对照组(参与者0-2)来评估(表方案对相同的血清样本进行皮质醇水平测量时，结果几乎相同(比较表3中的第3列和第4[0129]表II.5：分析头发中的皮质醇所[0137]受试者主要是从智利科金博市北天主教大学(UCN)的工作人员和学生志愿者中招评估参与者使用本发明设备的体验。该评估基于态度量表构建技术(李克特量表)的5个刻如参与者对棉签的了解或先前的使用情况。在访问期间还详细记录了一些人体测量数据，智利对照组的样本相比，这组参与者面临着越来越多且更为严重的麻烦和生活事件[0154]方法：将使用Trears收集的37个右耳耳垢样本的重量与使用传统临床方法[0159]一名耳鼻喉专科医生于2018年5月30日对本研究的临床研究助理进行了Reiner-[0166]请不要重复使用或清洗一次性吸头。清洁提示仅适用于一次性使用(每个耳道一[0168]请勿将TrearsTM插入至超过安全制动器允许的深度。超出安全制动范围内使用[0194]一次性清洁头上的海绵已预先使用氯化镁(MgCl2)润湿，所以具有不同的湿度水[0196]使用Kolmogorov-Smirnov统计测试和图解方法(包括直方图)检查数据的正态复t检验来比较基线左耳和右耳的耳垢提取量，以及基线和跟踪提取的耳垢提取量；使用Tears提取的耳垢的数量与不同生物变量之间的关联，或相同数量与客户满意度调查问题[0199]虽然提取的左右耳垢基线样本的量没有差异，但使用Trears提取的耳垢比使用不是减少。这可能是由于使用Reiner-Alexander注射器进行基线外耳清洁导致耳垢不足，从而使耳腺增加耳垢的分泌作为一种补偿机制。我们研究方案的设计也考虑到了这种差该方法比常规的提取方法提取了更多耳垢(2.25±0.18mg/周)。Cipriani等人(1986)垢葡萄糖浓度(EGC)代表一个之前未知时期的禁食和餐后葡萄糖水平的平均浓度，而后续基线和跟踪EGC和HbA1c样本预测了不同的血糖水[0225]尽管其他研究也在耳垢样本中测量了葡萄糖水平(Masuda等，1978；Shichjo&踪EGC和HbA1c样本预测了不同的血糖水萄糖[PSG]与其跟踪EGC和HbA1c也是如此。血糖水平的平均值与上述所有HbA1c和EGC指标[0234]在禁食8小时后收集右耳耳垢基线样本。在受试者用餐(标准的236毫升的[0238]使用TEARse仪器获得的耳垢样本通过用500μl的PBS冲洗海绵清洁头2分钟来进行处理。由于Trears的萃取机理是干燥的，因此用N2干燥的时间要少得多。实际上，与板读数器(NovoStar)中测量570nm的吸光度后，立即将混合物在37℃避光的条件下反应30ml的HbA1c标准品。将标准品和100μl标准品以及未稀释的血清添加到涂有涂有HbA1c抗体水平不受任何协变量的影响。尽管EGC与血糖水平之间的所有关联均显示出强正相关系数通常在葡萄糖水平升高的人群(例如糖尿病患者)中显示出更强的关联性(vantRiet等样本的耳垢分泌量。在这以前的剧烈体育活动或某些压力事件可能会暂时增加基线EGC样相关性都强于所观察到的HbA1c与血糖水平之间的相关系数，而且还因为跟踪EGC与PSG之位进行大约2到300次测量得出的平均葡萄糖水平几乎与HbA1c完全相关(R＝0.96)(Aaby健康人的平均血糖水平更相关，因为他们的24小时血糖水平变化幅度小于糖尿病患者[0267]受试者吸收不同膳食成分的能力的个体间差异也可能影响他们的血糖水平些急性影响是否确实会改变HCC。耳垢皮质醇浓度(ECC)可能是反映平均皮质醇浓度更方[0278]我们比较并关联了从跟踪耳垢样本中和在同一次访问中获得的1cm头发样本中获[0283]测定耳垢样本中的皮质醇：根据其供应商提供的说明(美国纽约州法明代尔Enzo去甲醇，并将试管冷冻在-80℃直至需要进行皮质醇ELISA。使用可商购的竞争性ELISA[0298]请见表13.[0300]使用Trears提取ECC比使用Reiner-Alexander注射器的效率明显更高。如果和分证实了先前研究的结论，即男性相比女性HCC升高(Garcia-Leon等，2018；Vanaelst等，24小时尿液收集或持续皮质醇水平的相关性也可能增加，有些证据表明HCC受一些急性因将ECC与指甲皮质醇水平相关联，这是另一个可能长期累积皮质醇水平的标本(Izawaet