CN113834925B 用于hdl和apoa1的纯化和检测的组合物和方法 （克利夫兰心脏实验室公司）

201580030344.X2015.05.15purificationofrecoapolipoproteinA-IZaragozparticles.ProteinExpresCharacterizationofApolipop用于HDL和APOA1的纯化和检测的组合物和本发明提供使用包含HDL亲脂核结合肽(例如，ApoA1的部分)和亲和标签的HDL标记分子纯一步提供用可检测标记的ApoA1分子标记样品中与原生ApoA1蛋白的比率的方法、试剂盒和组合2(a)使包含高密度脂蛋白(HDL)分子和非HDL生物分子的体液样品与HDL标记分子的群中所述标记的HDL分子的群组包含结合至少一些HDL分子的至少一些HDL(b)通过将所述混合样品与对所述亲和标签有特异性的捕获分子的群组接触纯化所述所述血液样品是血清样品或血浆样品，并且任选地其中所述血液样品包含低密度脂蛋白4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中产生所述纯化的样品进一步包括色谱5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，进一液样品与硫酸葡聚糖/氯化镁溶液接触并收集上清液，并且任选地其中所述上清液与步骤(a)使包含HDL分子的体液样品与HDL标记分子的群组接触以产生包含标记的HDL分子的群组的混合样品，其中HDL标记分子各自包含：(i)HDL亲脂核结合肽，其包含载脂蛋白(b)测量HDL的量以确定标记的HDL分子与非标记的HDL分子的比率，其中标记的HDL分3[0003]本申请要求2014年5月15日提交的美国临时申请号61/993,696的优先权，所述临[0004]本发明提供使用包含HDL亲脂核结合肽(例如，ApoA1的部分)和亲和标签的HDL标[0005]血清脂蛋白包含脂质-蛋白复合物的异质群体，所述复合物可基于与脂质和蛋白和LDL主要由脂质构成，而高密度脂蛋白具有较高的蛋白含量(约50％)。LDL的密度在别范围内的密度的溴化钾盐溶液。这些用于制备纯化的HDL的方法的一种缺点是其需要最它血浆蛋白在底部部分中。这种连续密度梯度超速离心程序是用于HDL的分离的“优质标[0006]本发明提供使用包含HDL亲脂核结合肽(例如，ApoA1的部分)和亲和标签的HDL标4所述混合的样品与对所述亲和标签有特异性的捕获[0008]在某些实施方案中，将所述HDL标记分子添加至所述初始样品中，使得标记的ApoA1分子与未标记ApoA1分子的比率为约1:10-10:1、1:5-4:1或约1:3-3:1或约1:2-2:1；述未标记ApoA1分子的比率在所述组合物中为1[0013]在特定实施方案中，本文中提供包含标记的HDL分子的组合物，其中所述标记的5[0016]在某些实施方案中，所述HDL亲脂核结合肽包含载脂蛋白A-I(ApoA1)的HDL结合子的至少一个置换(或结合所述亲脂核连同所述第一和第二原生ApoA1分子)在所述HDL分法在1小时或更少时间(例如1小时…45分钟…37分钟…30分钟…21分钟…15分钟…或10分6[0022]在某些实施方案中，所述标记的HDL分子的群组的所述至少一个特征是针对受试者的心血管疾病风险标志物并且用于受试者中的心血管疾病的诊断和/或治疗。在特定实ApoA1蛋白的样品经历质谱法，使得关于所述非片段化ApoA1蛋白产生质谱报告(例如电子6000…10,000…15,000…25,000…30,000…35,000或更高)的分辨率下执行。在一些实施方案中，所述非片段化ApoA1蛋白的至少一部分包含与增加的心血管疾病风险有关的至少方案中，谱报告包含关于包含至少一种修饰的氨基酸的所述非片段化ApoA1蛋白的部分的[0025]在某些实施方案中，本文中提供包括以下的方法：a)使纯化的HDL样品经历色谱法，使得产生大体上不含HDL相关磷脂的纯化的ApoA1样品，其中所述纯化的HDL样品包含HDL分子，并且其中所述纯化的ApoA1样品包含非片段化ApoA1蛋白；和b)使所述纯化的中，步骤a)中的所述经历和步骤b)中的所述经历通过将所述纯化的HDL样品注射至执行色[0027]在额外实施方案中，所述非片段化ApoA1蛋白的至少一部分包含与增加的心血管7包含所述标记的HDL分子的纯化的样品；和d)分析所述纯化的样品以便确定可检测标记的[0031]在某些实施方案中，经由本文所述的亲和标签纯化方法捕获的HDL的量与初始样[0032]在一些实施方案中，经由本文所述的亲和标签纯化方法捕获的原生ApoA1的量与初始样品中原生ApoA1的总量相比以便确定用作所述样品中HDL的逆向胆固醇转运能力的种观点正在改变(Florvall等人,JournalofGerontology:BIOLOGICALSCIENCES2006,[0035]a)混合含有HDL分子和非HDL生物分子的群组的初始样品与HDL标记分子的群组以8[0039]c)纯化所述标记的HDL分子的群组的至少一部分与所述非HDL生物分子分开以产[0040]2.如项1所述的方法，其中所述HDL亲脂核结合肽包含HDL标记分子与所述未标记ApoA1分子的比率为1[0042]4.如项2所述的方法，其中在所述HDL标记分子的至少一个置换在所述HDL分子的每一个中的所述第一原[0046]8.如项1所述的方法，其中在所述纯化的[0053]其中存在于所述组合物中的所述HDL标记分子与所述未标记分子的所述比率为1:[0057]14.如项10所述的组合物，其中所述9[0063]16.如项15所述的系统，其中所述HDL亲脂核结合肽包含载脂蛋白A-I(ApoA1)的[0071]20.如项19所述的组合物，其中所述HD[0073]图1示出当由实施例1中的方法分离时ApoA1(主要HDL相关蛋白)和血清白蛋白的[0074]图2示出来自实施例1的各种制剂的SDSpage，包括：1)梯带；2)血清(1:50稀释标称分辨率1000下操作的质谱仪时ApoA1的原生和氧化形式针对+35电荷状态(+H加合物)在标称分辨率2000下操作的质谱仪时ApoA1的原生和氧化形式针对+35电荷状态(+H加合用在标称分辨率10000下操作的质谱仪时ApoA1的原生和氧化形式针对+35电荷状态(+H加[0077]图5A和5B示出在大约2500FWHM的标称分辨率下操作的低分辨率离子阱(图5A)上所收集的ApoA1和ApoA1氧化形式的+35电荷状态的数据，而底部图(图5B)示出在>30,000FWHM的标称分辨率下qTOF仪器操作所收集的相[0078]图6示出来自HDL蛋白的混合物的质谱数据、针对ApoA1和血清白蛋白的特定信号上观察到的总信号。中间图(图6B)示出通过过滤在m/z803.38下针对+35电荷状态的数据[0080]图8示出条形图，所述条形图示出从使用标记的ApoA1与原生ApoA1的增加的比率[0081]图9A和9B示出A)扩增图，所述扩增图示出两个患者样品的快速纯化的HDL以及阳[0082]图10A和10B示出来自相同样品的人血清(A)和快速纯化的HDL(B)的粒子概况分稳定化的两亲蛋白构成，所述脂质乳液由用游离胆固醇(约4％)包埋的磷脂单层(约25％)和具有三酸甘油酯(约3％)和胆固醇酯(约12％)的核构成。HDL的亚类包括HDL2和HDL3。[0092]本发明提供使用包含HDL亲脂核结合肽(例如，ApoA1的部分)和亲和标签的HDL标[0096]所述HDL标记分子的HDL亲脂核结合肽组分可为可结合HDL分子(例如成熟HDL分中能够结合HDL的部分。ApoA1的HDL结合部分论述于例如MurphyISRNPhysiology,2013,域(例如包含A类两亲螺旋)。在某些实施方案中，HDL结合肽包含ApoA1模拟物或其片段。半胱氨酸可在称作ApoA1-米兰的突变型ApoA1中的位置173处取代精氨酸(Weisgraber等人[0101]在某些实施方案中，ApoA1的HDL结NO:1的氨基酸5-38或SEQIDNO:1的氨基酸1-43，除了一个或两个氨基酸缺失或改变但不氨基酸220-241或210-241或SEQIDNO:1的223-238或220-241，除了其中一个或两个氨基含SEQIDNO:1的氨基酸44-65或SEQIDNO:1的氨基酸47-62或SEQIDNO:1的氨基酸44-中，ApoA1的HDL结合区包含SEQIDNO:1的氨基酸1-43和220-241或SEQIDNO:1的氨基酸5-38和223-238或SEQIDNO:1的氨基酸1-43和220-241，除了一个或两个氨基酸缺失或改变但不破坏所述序列的HDL结合能力。在特定实施方案中，ApoA1的HDL结合区包含SEQIDNO:1的氨基酸1-43和/或220-241和/或44-65，或SEQIDNO:1的氨基酸5-38和/或223-238HDL结合能力。人ApoA1(SEQIDNO:1)的各种HDL结合区描述于Frank和Marcel,2000,采用Frank和Marcel、Tanaka等人所描述的方法和以下实施例来确定ApoA1的特定序列(例HDL脂蛋白的能力。所述变体可通过使用例如以下实施例中所述的分析来分析所提出的变体并且针对结合HDL进行测试来鉴别。氨基酸取代一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相[0104]本发明不受用作所述HDL标记分子的一部分的亲和标签限制。所述标签的实例包(一般为通过镍或钴螯合物结合的5-10个组氨酸)、Myc-标签(通过抗体识别的短肽、S-标被称作streptactin的修饰的抗生蛋白链菌素的肽)、TC标签(通过FlAsH和ReAsH双砷化合[0105]所述亲和标签可直接偶联于HDL磷脂核结合肽，或可通过如连接子的介入分子分中和由Tomalia等人在Angew.Chem.Int.Ed.En包含能够将第一和第二部分稳定地串在一起的任何共价或非共价分子偏振干涉测量法(“DPI”)、椭圆光度法和石英晶体微量天平(参看例如美国专利公布的前体序列之后的功能性蛋白并且在以下SEQIDNO:[0112]DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLN[0114]在一个示例性实施方案中，在血清或血浆中的完整ApoA1可通过质谱法由以下方法检测。为通过LC/MS进行分离并且检测作准备，完整ApoA1蛋白在大体上水性条件下(例述柱并且盐和其它亲水性污染物在溶剂的恒定流下被冲走。为了分辨ApoA1与可存在于样同溶剂组成下从所述柱洗脱。来自HPLC柱的洗脱液可转移至多个检测器(UV/Vis、光散射[0115]原则上，所鉴别的电荷状态中的任一个均可用于定量具有明显益处/限制的明对所述质谱仪的分辨率的影响。使用ApoA1和具有在+35电荷状态下的单一氧化的ApoA1且所述分析仪偏好使用低分辨率离子阱或四极。图5示出在大约2500FWHM的标称分辨率下操作的低分辨率离子阱(顶部图，图5A)上所收集的ApoA1和ApoA1氧化形式的+35电荷状态的数据。底部图(图5B)示出在>30,000FWHM的标称分辨率下qTOF仪器操作所收集的相同样辨在质谱仪中洗脱的复杂蛋白混合物。特定针对所选择的质量的产生色谱图(萃取离子色针对ApoA1和血清白蛋白的特定信号可如何通过过滤特定信号来选择性地进行提取。顶部z803.38下针对+35电荷状态的数据而导出的ApoA1信号。底部图(图6C)示出来源于在m/z[0119]在某些实施方案中，采用完整ApoA1(例如修饰的ApoA1)的质谱检测和/或本文所述的HDL纯化方案通过用所述方法测试患者样品来检测患者中的心血管疾病(CVD)或CVD的逆向胆固醇转运(RCT)是一种用于从肝外细胞和组织去除过量胆固醇和最终转运至肝脏以和标记的ApoA1)添加至系统中并且采用分析来确定多少所添加的ApoA1最终与HDL粒子缔记的ApoA1鉴别内源ApoA1并且所述标记可用于促进分离(例如，亲和标签用作所述标记)。者样品中提高水平的氧化的ApoA1可用于确定受试者处于患有心血管疾病的风险中(参看硫酸葡聚糖/氯化镁溶液混合。有力地搅动所述样品，在室温下孵育10分钟并且通过在6,[0129]为了实现HDL纯化，12uLApoB缺失的血清与24uL亲和标记的ApoA1和4uLPBS混记的ApoA1置换成熟HDL分子上的典型地4-7种原生ApoA1蛋白之一，由此添加标签至成熟HDL分子中。所述样品应用于含有Ni-NTA亲和介质的离心柱中以捕获his标记的ApoA1和缔液的200uL等分试样来洗脱结合的HD[0131]通过LC-MS和SDS凝胶电泳分析纯化的HDL蛋白库。关于在LC-MS之前的分析导至以全扫描模式操作的ThermoVelos[0133]使用分离的HDL粒子的胰蛋白酶和Lys-c消化的LC-MS/MS分析来确定HDL相关蛋15min.梯度)分离所得肽并且通过LTQ-OrbitrapElite质谱仪进行检测。使用MaxQuant软[0137]Pon1是具有规定酶活性的HDL相关蛋白。根据Eckerson等人(AmJHum[0139]在VascularStrategies上评估胆固醇流出。所述分析确定了分离的HDL经由的质谱方法未针对蛋白质组覆盖的深度进行优化，但所鉴别的蛋白ID列表(下表1)与文献[0146]从亲和柱洗脱的HDL相关蛋白的高度富集组成证明了来自血清的HDL粒子使用上文所述的亲和标记的ApoA1方法成功地分离。在HDL制备中仅鉴别了两种非特异性蛋白(血清白蛋白和核结合蛋白)。血清蛋白被识别为所有基于血清的蛋白质组学实验中的普遍存在污染物。核结合蛋白未作为HDL相关蛋白加以报告并且可表示对用于捕获his标记的LC-MS/MS操作的强度数据的分析指示了his-标签纯化含有比可相当的超速离心制备少大[0152]通过亲和色谱法进行的亲和ApoA1纯化的两种示例性益处是速度和纯度。使用亲[0156]这一实施例描述了使用来自LDL缺失的或纯(非ApoB/LDL缺失的)血清的亲和标记小时以使HDL相关蛋白特异性地裂解为用于LC-MS表征的特异性肽。[0160]来自快速纯化的HDL的LysC消化的肽产物使用在溶剂A(水+0.1％甲酸)中递增浓[0162]对HDL相关蛋白有特异性的肽以及标记的ApoA-I在纯血清和LDL缺失的血清样品NTA亲和顺磁珠粒添加至所述样品中并且短暂地孵育以结合并入所述标记的ApoA1的HDL分添加至洗脱的HDL样品中并且在37℃下孵育四小时以使HDL相关蛋白特异性地裂解为用于LC-MS表征的特异性肽。[0169]来自快速纯化的HDL的LysC消化的肽产物使用在溶剂A(水+0.1％甲酸)中递增浓[0171]图8示出标记的ApoA1、原生ApoA1和来自同一血清样品的纯化的HDL分子的原生记的ApoA1可使用15N同位素标记从而产生可通过质谱法检测的独特质量特征的标记的所述机制来实施本发明，但相信his标记的ApoA1置换成熟HDL分子上的典型地4-7种原生HDL粒子中多个ApoA1分子被置换，从而以较大速率置换原生ApoA1的结果。未交换的另一HDL特异性蛋白ApoA2的测量充当总的HDL回收的指示。观察到ApoA2在1:1比率下增至最大并且当标签:原生ApoA1的比率进一步增加时达到稳[0174]这一实施例描述了用于表征通过本文所述的亲和标记的方法分离的HDL的额外程[0176]His6标记的ApoA-I(0.5mg/mL)与人血清以1:2体积比组合并且在37℃下孵育15分在干燥氮气流下蒸发。所述脂肪酸甲酯通过添加氢氧化钠水解为脂肪酸并且随后通过LC-C22:5n6，二十二碳五烯-6酸，0.3C20:5n3二十碳五烯酸0.8C22:6n3二十二碳六烯总RNA使用PureLinkmiRNA分离试剂盒(LifeTechnologies)分离并且再悬浮于无核酸酶的水中。使用TaqMan微RNA逆转录试剂盒(LifeTechnologies)执行逆转录。5μL总RNA(1-12ul的无核酸酶的水混合。3μL5xRT引物接着添加至共计15μL的RT反应混合物中。在[0180]使用TaqMan微RNA单一分析(分析ID002295,LifeTechnologies)来评估成熟LifeTechnologiesStandard7500实时PCR系统中执行实时PCR，其中循环条件为95℃持类似于从未处理的血清样品(阳性对照)分离的miRNA的那[0182]His6标记的ApoA-I(0.5mg/mL)与人血清以1:2体积比组合并且在37℃下孵育15分清中用30μL300mM咪唑洗脱。10μL在反萃取的血清中洗脱的HDL通过微流体电泳使用和HDL3粒子的存在的峰(图10)处于类似