Westernblot蛋白质双向电泳的原理方法及在医学中的应用最终版

（优选）Westernblot蛋白质双向电泳的原理方法及在医学中的应用最终版第一页，共57页。2Westernblot原理及方法蛋白质印迹法1第二页，共57页。3Westernblotting19751979同年最终EdwardM.Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法McMaster和Carmichael对RNA进行印迹分析，发明Northern印迹技术

GeorgeStark对电泳后的蛋白质分子进行印迹分析从而发明western印迹技术

Westernblotting！！第三页，共57页。4

什么是蛋白质印迹法？

Westernblot法是凝胶电泳技术、固定化技术及分子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在于把凝胶已分离的区带并印迹于固化纸上，可分为电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定的方法。第四页，共57页。5

为什么要作蛋白质印迹实验

？2不同的样品中检查蛋白质的表达情况，上调或下调表达，如疾病和正常的样品之间的表达差异性1研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中第五页，共57页。

在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。

WesternBlot的基本原理第六页，共57页。蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗孵育二抗孵育底物显色

WesternBlotting

操作流程第七页，共57页。8第一步转

膜

第三步一抗杂交第五步底物显色第四步二抗杂交

第二步封

闭

WesternBlotting

操作流程第八页，共57页。优点：1.快速（一种抗体）2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带缺点：1.免疫反应性降低2.无信号二级放大3.抗体标记费时昂贵,使用不方便

WesternBlotting方法一:直接法第九页，共57页。优点：1.免疫特异性不受标记影响2.信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点）3.多种标记的二抗可供选择4.可选择不同的Marker缺点：1.交叉反应引起的非特异性条带2.额外的二抗孵育以及条件优化

WesternBlotting方法二:间接法第十页，共57页。直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不知一个二抗分子，所以二抗可以增强信号，所以一般情况下都采用间接法进行检测为什么一般情况下都采用间接法进行检测？第十一页，共57页。

WesternBlotting间接法操作流程第十二页，共57页。分子量标准显色结果抗体膜的选择

WesternBlotting设计标准第十三页，共57页。14

不可小看“蛋白标准”--分子量标准的选择分子量标准预混分子量标准修饰分子量标准预染分子量标准第十四页，共57页。预混分子量标准高分子量标准低分子量标准宽分子量标准预染分子量标准单色预染多色预染修饰分子量标准

糖基化

磷酸化

荧光标记

不可小看“蛋白标准”--分子量标准的选择第十五页，共57页。高分子量标准低分子量标准宽分子量标准

预混分子量标准第十六页，共57页。单色预染多色预染

预染分子量标准第十七页，共57页。糖基化磷酸化荧光标记

修饰分子量标准第十八页，共57页。价格便宜，简单快速封闭与非特异性抗体结1.硝酸纤维素膜（NC膜）灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，对蛋白的吸附能力要远远大于NC膜2.PVDF膜对核酸和蛋白质具有很强的结合能力，能代替NC膜用于分子印迹和杂交实验。3.尼龙膜

膜—三种选择第十九页，共57页。

选择标准1.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）2.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）3.后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜

选择膜的标准第二十页，共57页。

膜的特点第二十一页，共57页。作为western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性；而可用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。

抗体的选择第二十二页，共57页。方便、便宜、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测化学显色法灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰期短同位素法灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测化学发光法Krypton™荧光底物荧光底物法显色的方法玩转大学PPT素材更多好素材请访问

第二十三页，共57页。24蛋白质双向电泳的原理Enteryoursubtitlehere2第二十四页，共57页。25

双向电泳的实验原理◆第一向：等电聚焦◆第二向：SDS—PAGE电泳第二十五页，共57页。第一向：等电聚焦第二十六页，共57页。聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(Arc)和交联剂N,N-甲叉丙烯酰胺(Bis)在加速剂N,N,N’—四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂硫酸铵（AP）或核黄素的作用下聚合交联成三维网状的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为PAGE。

第二向：SDS—PAGE电泳第二十七页，共57页。第二十八页，共57页。29第二十九页，共57页。30蛋白质双向电泳的方法Enteryoursubtitlehere3第三十页，共57页。31技术流程双向电泳(2DE/DIGE)实验组和对照组样品制备提出生物学问题凝胶图像分析差异蛋白点选取蛋白酶解及质谱分析差异蛋白点的成功鉴定生物学问题的解释第三十一页，共57页。目前进行蛋白质组学分析的最常规实验技术能实现多达10000种不同蛋白质进行分离分析

双向电泳(2DE/DIGE)第三十二页，共57页。等电聚焦，实现蛋白质按等电点进行分离分子量大小通过双向电泳使得不同等电点和分子量的蛋白质根据其自身特性分布到凝胶的不同位置从而实现蛋白质的双向分离SDS分离，使得蛋白质按分子量大小排序

双向电泳（2DE）示意图第三十三页，共57页。硝酸银染色图谱考马斯亮蓝染色图谱

2DE图谱第三十四页，共57页。将标记的样品混合双向电泳分离荧光扫描仪扫描图像重叠分析样品1：Cy3标记

双向电泳（DIGE）示意图第三十五页，共57页。

DIGE图谱第三十六页，共57页。双向电泳的最关键步骤之一制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽可能简单的操作步骤，注意防止样品提取过程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐离子等干扰物质

样品制备第三十七页，共57页。第三十八页，共57页。变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂TritonX-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或

-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。

增加样品溶解性的手段第三十九页，共57页。起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。第四十页，共57页。通过10000V高压使得蛋白质按照其等电点特性进行聚焦步骤：胶条水化、低压除盐、高压聚焦、低压维持聚焦时间：聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹，过长会造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据蛋白样品类型、蛋白载样量、PH范围和胶条长度来确定。

等电聚焦第四十一页，共57页。理想显色剂的7S安全（safety）灵敏（sensitivity）简单（simplicity）特异性（specificity）快速（speed）稳定（stability）兼容性（synergy）

蛋白检测第四十二页，共57页。硝酸银染色优点：灵敏度高，缺点：重复性差，质谱兼容性低考马斯亮兰染色：优点：重复性好，质谱兼容性高缺点：灵敏度低荧光染色：优点：重复性好，质谱兼容性高、灵敏度高缺点：价格贵其它染色方法：胺基黑染色、印度墨水染色、金属盐负染等

蛋白检测第四十三页，共57页。常用软件：Image-Master(GEHealthcare)PDquest(Bio-Rad)分析步骤：胶点检测和定量、凝胶匹配、比较分析

图像分析第四十四页，共57页。凝胶图像的扫描：图像加工：

斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：数据呈递和解释：2-DE数据库的建立：

凝胶的图像处理分析和典型流程第四十五页，共57页。46

应用Westernblot及蛋白质双向电泳4第四十六页，共57页。aboutWesternBlot的医学应用第四十七页，共57页。Westernblot法诊断囊虫病应用荧光定量PCR和Western-blot检测RNA干扰肺腺癌A549细胞STAT3基因表达水平Western-blot法测定风疹病毒特异性抗原

WesternBlot的三大医学应用第四十八页，共57页。1、Westernblot法诊断囊虫病囊虫病是由猪带绦虫幼虫即囊尾蚴寄生于人体引起的人兽共患寄生虫病。第四十九页，共57页。免疫学试验对本病诊断有重要作用，但目前用各种方法纯化的抗原其敏感性、特异性均不理想。运用DNA重组技术,构建来源于猪囊尾蚴的cDNA表达文库,以囊虫病患者血清及病猪血清为抗体,从中筛选出4个特异性抗原（cC1、cC2、cP1、cH1）,这些抗原克隆经IPTG诱导,形成β-半乳糖苷酶-猪囊尾蚴特异性抗原的融合蛋白(fusionprotein,FP)。采用简化Westernblot法,以等比混和的四种融合蛋白为抗原检测囊虫病、华支睾吸虫病、包虫病患者血清中的相应抗体第五十页，共57页。2、应用荧光定量PCR和Western-blot检测RNA干扰肺腺癌A549细胞STAT3基因表达水平

Western印迹分析检测STAT3表达荧光定量PCR检测STAT3mRNA的表达

第五十一页，共57页。凋亡相关蛋白的表达WesternBlot检测发现WesternBlot检测SZL作用48h后凋亡相关蛋白表达的变化Bandleader软件分析凋亡相关蛋白的相对表达率

WesternBlot检测结果的密度分析扫描直方图(凋亡相关蛋白相对表达率=条带灰度值/actin灰度值)第五十二页，共57页。3、Western-blot法测定风疹病毒特异性抗原风疹病毒(ＲＶ)能够引起先天感染。通过孕妇传播,致使胎儿先天畸形或导致先天性风疹综合征如先天性心脏病、智力低下等。因此能够早期快速诊断对于优生优育、提高人口素质、预防后天及再感染具有重要意义。目前临床上所用的ELISA检测试剂盒所包被抗原为全细胞粗制