细胞基因组的提取

细胞基因组的提取演示文稿第一页，共22页。（优选）细胞基因组的提取第二页，共22页。核酸制备时应注意的事项:①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。②减少化学因素对核酸的降解。③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温④防止核酸的生物降解。

3、核酸制备的一般原则一、实验原理第三页，共22页。核酸制备的步骤：破碎细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中第四页，共22页。核酸酶的抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。4、核酸制备的一般方法和原理一、实验原理第五页，共22页。核酸酶的抑制和抑制剂DNase抑制

①加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。第六页，共22页。核酸酶的抑制和抑制剂RNase抑制①操作要带手套。②所有器皿要严格消毒，③试剂处理④低温操作⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。

第七页，共22页。核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠第八页，共22页。核酸制备中常用的蛋白质变性剂

蛋白质变性剂的作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。

如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC第九页，共22页。核酸制备中常用的酶

DNaseRNase蛋白酶K溶菌酶

第十页，共22页。核酸提取的一般过程1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）

微生物：溶菌酶、SDS裂解。

高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。

动物：液氮处理后用匀浆器破碎。

细胞器DNA：首先纯化细胞器。

以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂第十一页，共22页。核酸提取的一般过程2）破碎抽提核酸除去杂质1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离2．使核酸与蛋白质分离3．除去脂类4．多糖的除去第十二页，共22页。核酸提取的一般过程3）核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。

第十三页，共22页。4）核酸样品的保存核酸保存的主要条件是温度和介质

温度：4℃（5℃）最佳和最简单-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存-20℃保存

保存介质：TE缓冲溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0第十四页，共22页。实验目的第十五页，共22页。材料与试剂第十六页，共22页。实验操作与注意事项,1000rpm,5min离心第十七页，共22页。第十八页，共22页。第十九页，共22页。四、注意事项——材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集第二十页，共22页。四、注意事项——细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯