高中生物配套苏教选修生物化学与分子生物学技术实践

高中生物配套课件苏教选修生物化学与分子生物学技术实践第一页，共48页。第一页，共48页。一、蛋白质的分离与纯化1.实验原理依据蛋白质的不同特性，将不同种类蛋白质分开，再依据____________________________________的差异进行纯化。质之间以及蛋白质与其他物质之间蛋白第二页，共48页。第二页，共48页。2.步骤第三页，共48页。第三页，共48页。【点拨】(1)蛋白质与蛋白质、蛋白质与其他物质之间的差异主要表现在分子大小、溶解度、所带电荷的多少、吸附性质等方面。(2)电泳时，带电的颗粒向与其电性相反的电极方向移动。第四页，共48页。第四页，共48页。二、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳1.原理不同的物质在同一电场中的__________不同，泳动速度主要取决于__________________。一般来说，带电颗粒直径______，越接近于球形，所带净电荷_______，在电场中的泳动速度越快。2.步骤配制试剂→架滤纸桥→浸泡薄膜→__________→平悬薄膜→__________→染色→漂洗→________泳动速度带电颗粒的性质越多越小细心点样脱色实施电泳第五页，共48页。第五页，共48页。【点拨】(1)醋酸纤维薄膜上的缓冲液有利于维持蛋白质的正常形态和电泳时蛋白质分子的泳动，在吸取薄膜表面的缓冲液时不宜吸得太干。(2)点样的整齐与否直接影响电泳结果蛋白质条带的区分。第六页，共48页。第六页，共48页。三、PCR扩增DNA的过程1.参与的组分及作用参与的组分在DNA扩增中的作用模板DNA__________________________________合成子链的原料Taq聚合酶___________________________使Taq聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸Mg2+____________________________提供DNA聚合反应的离子条件催化合成DNA子链4种脱氧核苷酸提供DNA扩增的模板引物第七页，共48页。第七页，共48页。94℃→双链DNA解旋成单链DNA40℃～60℃→引物与作为模板的单链DNA特定部位相互配对、结合延伸第八页，共48页。第八页，共48页。【点拨】解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶和DNA连接酶催化形成的是磷酸二酯键。第九页，共48页。第九页，共48页。蛋白质的分离与纯化方法的比较

方法项目透析法离心沉降法电泳法原理分离结果是否需要缓冲液蛋白质分子不能透过半透膜控制离心速率，使分子大小、密度不同的蛋白质沉降分层不同带电颗粒在同一电场中的泳动速度不同需要不需要需要将蛋白质和小分子化合物分开将蛋白质沉降分层将蛋白质分离开来第十页，共48页。第十页，共48页。【高考警示钟】提取蛋白质后，只采用一种方法可能无法将蛋白质纯化，可以采用多种分离与纯化方法结合使用的措施将蛋白质进行分离、纯化。第十一页，共48页。第十一页，共48页。【典例训练1】(2010·江苏高考)某种蛋白酶是由129个氨基酸脱水缩合形成的蛋白质。下列叙述正确的是()A.该蛋白酶分子结构中至少含有129个氨基和129个羧基B.该蛋白酶溶液与双缩脲试剂发生作用产生紫色反应C.利用透析法纯化该蛋白酶时，应以蒸馏水作为透析液D.用含该蛋白酶的洗衣粉去除油渍，效果比其他类型加酶洗衣粉好第十二页，共48页。第十二页，共48页。【解题指南】1.考查实质：本题考查蛋白酶的化学本质、组成、结构及鉴定等。2.解题关键：(1)缓冲液能保持蛋白质的活性；(2)蛋白酶的本质是蛋白质，具有专一性，只能水解蛋白质。第十三页，共48页。第十三页，共48页。【解析】选B。该蛋白酶只有一条链时，所含有的氨基和羧基数目最少，都至少含有一个，Ａ项错误。因其本质为蛋白质，故可与双缩脲试剂发生作用产生紫色反应，Ｂ项正确。用透析法纯化蛋白酶时，应用缓冲液做透析液以保持蛋白酶的活性，C项错误。因酶具有专一性，油渍为脂肪，故利用含蛋白酶的洗衣粉去油渍比用含脂肪酶的效果差。第十四页，共48页。第十四页，共48页。【互动探究】(1)用离心沉降法分离该蛋白酶和其水解产物的混合物时，该蛋白酶沉降在离心管的哪一部位？提示：沉降在离心管的底部。该蛋白酶分子比其水解产物大，离心时沉降在离心管的底部。(2)B项中鉴定时应如何使用试剂？提示：双缩脲试剂包括A液(质量分数为0.1g/mL的氢氧化钠溶液)和B液(质量分数为0.01g/mL的硫酸铜溶液)，使用时要先加入A液再加入B液，然后振荡摇匀并观察颜色变化。第十五页，共48页。第十五页，共48页。DNA和蛋白质技术1.DNA与蛋白质在不同NaCl溶液中溶解度不同2mol/L

NaCl溶液0.14mol/L

NaCl溶液溶解规律DNA溶解析出

蛋白质部分发生盐析沉淀溶解NaCl溶液从2mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大第十六页，共48页。第十六页，共48页。2.比较细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR)项目DNA复制PCR扩增不同点场所能量酶是否有转录特点循环次数细胞内细胞外ATP提供能量不需ATP提供能量解旋酶、DNA聚合酶耐高温的TaqDNA聚合酶伴有转录,产生引物无转录,需加入两种引物边解旋边复制,半保留复制体外迅速扩增受生物体自身控制30多次第十七页，共48页。第十七页，共48页。项目DNA复制PCR扩增不同点缓冲液设备相同点原料复制原理模板引物不需要需要人为控制无严格控制温度变化的温控设备四种脱氧核苷酸严格遵循碱基互补配对原则DNA为模板都需要与模板相结合的引物第十八页，共48页。第十八页，共48页。3.分离DNA、PCR技术、分离蛋白质三者比较分离DNAPCR技术分离蛋白质实验原理DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，且不溶于冷酒精利用DNA热变性原理体外扩增DNA依据相对分子质量的大小不同来分离蛋白质实验过程选取材料→破碎细胞释放DNA→除杂→DNA析出与鉴定变性→复性→延伸样品处理→凝胶色谱操作第十九页，共48页。第十九页，共48页。分离DNAPCR技术分离蛋白质实验结果获得较纯净的DNA获得大量DNA相对分子质量不同的蛋白质得以分离实验意义为DNA研究打下基础解决了DNA研究中材料不足的问题为蛋白质的研究和利用提供了原材料第二十页，共48页。第二十页，共48页。【高考警示钟】比较琼脂糖凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)从载体上看，利用琼脂糖凝胶作为载体的是琼脂糖凝胶电泳，利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶作为载体的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。(2)从依据上看，利用了分子带电性质差异和分子大小的是琼脂糖凝胶电泳，仅利用了分子大小的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。(3)从优点上看，琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需处理，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了净电荷对迁移率的影响，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。第二十一页，共48页。第二十一页，共48页。【典例训练2】(2011·江苏高考)请回答基因工程方面的有关问题：(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。第二十二页，共48页。第二十二页，共48页。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为________。②在第_________轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。第二十三页，共48页。第二十三页，共48页。(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。第二十四页，共48页。第二十四页，共48页。第二十五页，共48页。第二十五页，共48页。(4)用限制(性核酸内切)酶EcoRV、MboⅠ单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1kb即1000个碱基对)，请画出质粒上EcoRV、MboⅠ的切割位点。第二十六页，共48页。第二十六页，共48页。【解题指南】1.考查实质：本题以基因工程为载体考查PCR技术的原理、过程以及应用。2.解题关键：了解PCR技术的过程，理解引物设计的原则，分析不同限制酶的切割位点。第二十七页，共48页。第二十七页，共48页。【解析】(1)①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为15/16。②在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，原因①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上。第二十八页，共48页。第二十八页，共48页。答案：(1)①15/16 ②三(2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上(4)见图第二十九页，共48页。第二十九页，共48页。【互动探究】(1)题(1)中变性、退火、延伸需要的温度分别是多少？提示：94℃、40℃～60℃、72℃左右。分析：当温度上升到94℃时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到40℃～60℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升到72℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。第三十页，共48页。第三十页，共48页。(2)PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物A延伸而成的DNA单链作为模板时将如何延伸？提示：与引物B结合进行DNA子链的延伸。分析：当引物A延伸而成的单链作模板时，此单链引物端为5′端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即由引物B结合延伸的子链。第三十一页，共48页。第三十一页，共48页。1.已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的是()第三十二页，共48页。第三十二页，共48页。A．若将样品以2000r/min的速度离心10min，分子戊在沉淀中，则分子丙也一定在沉淀中B．若用凝胶色谱法分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快C．将样品装入透析袋中透析12h，若分子丙保留在袋内，则分子乙也一定保留在袋内D．若用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子丁形成的电泳带相距最远第三十三页，共48页。第三十三页，共48页。【解析】选A。分子丙的相对分子质量大于分子戊的，所以，在离心时分子戊存在于沉淀中，分子丙也一定在沉淀中；用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子甲相对分子质量最小，容易进入凝胶内部，则移动速度最慢；分子丙的相对分子质量大于分子乙，则分子丙保留在袋内，分子乙可能在袋外；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移速度完全取决于分子的大小，因此，分子甲与分子丙形成的电泳带相距最远。第三十四页，共48页。第三十四页，共48页。2.关于蛋白质提取的叙述中，不正确的是()A．分离与纯化蛋白质之前首先要用适当的方法使蛋白质释放出来B．抽提时要依据蛋白质的不同特性选择不同的溶剂C．对蛋白质的粗提取物离心可除去一些小分子杂质D．蛋白质的粗制品可能是多种蛋白质的混合物【解析】选C。分离细胞中的蛋白质时需要将细胞破裂使蛋白质释放出来；抽提时要依据蛋白质的不同特性选择不同的溶剂，如酸性蛋白质选用稀碱性溶液提取；对抽提得到的粗提取物离心可除去固体杂质。第三十五页，共48页。第三十五页，共48页。3.下列关于离心沉降的说法中，不正确的是()A．目标不同，需要控制不同的离心速率B．能将分子大小、密度不同的蛋白质分离C．离心时，离心管内的溶液量要相同，但不需要对称放置在离心机内D．离心后，分子大小、形状不同的蛋白质会分布在不同的沉降层中【解析】选C。离心沉降法是通过控制离心速率，使分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层，从而达到分离出不同种类蛋白质的目的，离心时，离心管一定要对称放置。第三十六页，共48页。第三十六页，共48页。4.(2012·泰州模拟)下列关于PCR技术的叙述，错误的是()A．PCR技术和DNA体内复制所用到的酶种类有所不同B．PCR反应过程要消耗四种脱氧核苷酸C．PCR反应用到的引物是一小段DNA或RNAD．原料是从子链的5′端连接上来的第三十七页，共48页。第三十七页，共48页。【解析】选D。PCR技术是在体外模拟体内DNA的复制过程，二者需要的条件基本相同，如DNA模板、DNA聚合酶、引物、需要四种脱氧核苷酸等，所不同的是体内解链是靠解旋酶，体外解链是靠高温变性，体内的引物是RNA片段，体外的引物是DNA或RNA片段；不论是体内复制还是PCR技术，原料都是从子链的3′端连接上来的。第三十八页，共48页。第三十八页，共48页。5．下列关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的说法中，不正确的是()A．加滤纸桥时，待滤纸条湿润后，要驱除气泡，以便使滤纸紧贴于支架上B．浸泡薄膜时要识别出光泽面，并做记号C．平悬薄膜时，有记号的一面朝上D．从染色液中取出薄膜后，用滤纸条压平并吸干，再浸入透明液中脱色【解析】选D。薄膜染色后要先放入漂洗液中漂洗数次，直至蛋白质区底色脱净，然后再用透明液脱色。第三十九页，共48页。第三十九页，共48页。6.下列有关蛋白质提取和分离的说法，正确的是(多选)()A．透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不能通过半透膜的特性B．采用透析法使蛋白质与其他小分子化合物分离开来C．离心沉降法通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离D．蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相同的电极方向移动第四十页，共48页。第四十页，共48页。【解析】选A、B、C。电泳法分离物质的原理是在电场中，带电物质能向与自身所带电荷相反的方向移动，移动的速度和距离取决于物质所带电荷的量及相对分子质量。第四十一页，共48页。第四十一页，共48页。7.下面是某研究小组开展的“猪血浆某白蛋白的提取及相对分子质量测定”研究，请协助完成有关问题：材料仪器：新鲜猪血、低速冷冻离心机、透析袋、电泳仪等。化学试剂：pH为7.4的缓冲液、柠檬酸钠、奈氏试剂(与NH4+反应出现黄色或红棕色沉淀)、饱和(NH4)2SO4溶液、生理盐水等。实验步骤：(1)样品获取：向新鲜猪血中加入__________________，静置一段时间后取上层血浆。第四十二页，共48页。第四十二页，共48页。(2)盐析法粗提蛋白质：①向血浆中加入一定体积饱和(NH4)2SO4溶液，使(NH4)2SO4的浓度达到50％，充分混合后静置、离心，取沉淀物。②向沉淀物中加入适量生理盐水使之溶解，再向其中加入一定体积的饱和(NH4)2SO4溶液，使(NH4)2SO4的浓度达到33％，充分混合后静置、离心，取沉淀物。③重复步骤①、②2～3次，最后用生理盐水将沉淀物溶解即得粗提品。盐析粗提“血浆某白蛋白”的主要原理是_______________________________________，重复步骤①、②的主要目的是_______________________________________________。第四十三页，共48页。第四十三页，共48页。(3)透析除盐：将粗提品装入透析袋，以pH为7.4的缓冲液作透析液，每隔4h更换一次透析液，每次更换前利用奈氏试剂检测透析液中NH4