T-CVMA 244-2025 口蹄疫O型、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼 吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析 检测方法

CCSB41T/CVMA244—2025吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析检测方法againstFMDVtypeO、ASFV、CSFV、PRRSV2025-5-19发布2025中国兽医协会发布IT/CVMA244—2025本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本标准涉及专利。本标准由兰州兽研生物科技有限公司提出。本标准由中国兽医协会归口。本标准起草单位：兰州兽研生物科技有限公司、中国农业科学院兰州兽医研究所、青海省动物疫病预防控制中心、河北省动物疫病预防控制中心、隆回县动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：蒋韬、林密、孙燕燕、闫丽欢、张海霞、李昕、杨光、贺华丽、李涛善、包艳芳、郭建宏、何继军、杨吉飞、张立成、王谢忠、李翀、魏泽华、张腾帅、周早花。T/CVMA244—2025本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到条目5、7、8、9、10、11、附录A和附录B相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构承诺，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：专利持有人姓名：兰州兽研生物科技有限公司地址：甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。1T/CVMA244—2025口蹄疫O型、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析检测方法本文件描述了口蹄疫O型、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析检测方法。本文件适用于猪血清中口蹄疫病毒O型抗体、非洲猪瘟病毒抗体、猪瘟病毒抗体、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体快速检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1胶体金免疫层析技术Colloidalgoldimmunochromatographyassay；GICA以胶体金作为示踪物，将抗原抗体固定在硝酸纤维素膜上，通过层析来呈现免疫反应结果的一种免疫标记技术。4缩略语下列缩略语适用于本文件。ASFV：非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus）CSFV：猪瘟病毒（Swinefevervirus）FMDV：口蹄疫病毒（Foot-and-MouthDiseaseVirus）PEG6000：聚乙二醇6000（PolyethyleneGlycol6000）PRRSV：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus）SDS：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SodiumDdodecylSulfatePolyacrylamideGelElectrophoresis）2T/CVMA244—20255技术原理采用胶体金免疫层析技术，检测口蹄疫O型病毒、非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体。通过样本与免疫胶体金标记物沿层析膜移动，样本中目标抗体分别与四种免疫胶体金标记物、检测线（T线）上的抗原结合而显色，免疫胶体金标记物继续移动与质控线（C线）上的抗体结合显色。若某病毒对应的观测窗里的C线与T线均显色，则该待测样本含有对应病毒抗体；若某病毒对应的观测窗里的C线显色且T线不显色，则该待测样本不含有对应病毒抗体。6试剂与耗材6.1口蹄疫O型病毒纯化抗原146S，见附录A的A.1。6.2非洲猪瘟病毒重组p30蛋白，见A.2。6.3猪瘟病毒重组E2蛋白，见A.3。6.4猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白，见A.4。6.5口蹄疫、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析试纸条，见附录B。6.6相关试剂配制，见附录C。7器材7.1三维划膜喷金仪。7.2数控高速斩切机。7.3隔水式恒温培养箱。7.4磁力搅拌器。7.5可调单道移液器（10μL~100μL、100μL~1000μL）。8样品采集及保存8.1样品采集按照NY/T541规定进行样品的采集和处理。无菌注射器静脉采血，不少于2mL，用自然析出法分离血清后，置于无菌血清管中。血清清亮，无溶血，无污染。8.2血清样品的保存与运输按照NY/T541规定进行血清样品的存放与运输。血清样品置2℃~8℃条件下保存。若超过一周检测，置于-20℃以下冷冻保存。9操作步骤9.1取检测卡3T/CVMA244—2025将试剂盒从2℃~8℃取出，平衡10min，拆除铝箔袋，将试纸卡平放在桌面上。9.2加样及孵育用移液器吸取血清样本，向各样品孔中加入30μL，之后再分别向样品孔中各滴加30μL扩展液。结果将在10min内出现在观测框。10试验成立条件试纸卡C线显色，试验成立，结果有效；C线不显色，试验不成立，结果无效。11结果判定观察各观测窗内T线色带有无，按照如下标准分别进行判定。被检血清样品C线与T线均出现清晰可见红色条带，判定为阳性；被检血清样品仅C线出现清晰可见红色条带，T线不显色，判定为阴性。图1本联检试纸卡各观测窗检测结果示意图4T/CVMA244—2025抗原制备A.1口蹄疫O型病毒纯化抗原146S制备A.1.1毒种的繁殖与灭活将O/MYA98/JSCJ/2010细胞毒种，按维持液5%~10%的量接种至生长良好的BHK-21单层细胞，于37℃培养8h~12h。当达到90%以上细胞病变时，用7.5%NaHCO3溶液调pH至7.6~7.8，加入青霉素（100IU/mL）、链霉素（100IU/mL），用2mmol/L二乙烯亚胺在30℃下灭活24h，加入2%硫代硫酸钠阻断。2℃~8℃4000r/min离心30min，取上清即为O/MYA98/JSCJ/2010灭活制苗病毒抗原液。-20℃冻存。A.1.2抗原的去脂与浓缩将-20℃保存的O/MYA98/JSCJ/2010制苗灭活病毒抗原解冻，按80g/L加入PEG6000和40g/L加入NaCl，充分搅拌4h，2℃~8℃过夜；后8000r/min离心45min，弃上清；用PB缓冲液悬浮沉淀（冰上操作），匀浆器反复研磨，至终体积100mL；加入2倍体积的三氯乙烯于密闭容器中，剧烈振荡充分乳化，后在2℃~8℃8000r/min离心30min，收集上层液；继续2℃~8℃、45000r/min离心3h，弃上清；PB缓冲液悬浮沉淀，匀浆器中研磨，至终体积6mL；加入1%的脱氧胆酸钠溶液，充分摇匀，2℃~8℃过夜，即为浓缩病毒抗原。A.1.3蔗糖密度梯度离心配制45%、35%、25%、15%四种浓度梯度蔗糖溶液；在离心管中先加入45%蔗糖溶液2.5mL，再依次叠加35%、25%、15%蔗糖溶液2.5mL，制备6个蔗糖梯度柱，2℃~8℃静置过夜；次日将浓缩病毒抗原液分别加入6个蔗糖梯度柱顶部（每个柱子加入1mL2℃~8℃、35000r/min离心2.5h。A.1.4抗原146S收集离心结束后，取1管自上而下吸取梯度离心抗原，每0.5mL作为1个收集级分，对收集的级分进行顺序编号，共收集22个级分。其余5管重复上述操作。用紫外分光光度计测定22个级分OD259nm值，将OD259nm大于0.4的级分合并，作为口蹄疫O型病毒纯化抗原146S。A.2非洲猪瘟病毒重组p30蛋白制备将实验室保存的pET-28a-p30重组阳性质粒转化至Rosetta感受态细胞中，挑取单克隆后进行测序；将测序正确的菌液1﹕100加入到2×YT培养基扩大培养至OD600nm为0.6~0.8后，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG在37℃诱导表达4h，12000r/min离心10min后收集沉淀；PBS重悬沉淀后反复冻融3次，超声破碎至液体清亮（超声条件：电压200V，工作3s，暂停3s12000r/min离心10min，分别收集沉淀和上清，SDS分析蛋白的表达情况。将沉淀使用8mol/L的尿素裂解后复性，使用Ni柱法进行纯化（用终浓度为20mmol/L和50mmol/L的咪唑洗脱杂蛋白3次，每次10mL，后使用200mmol/L的咪唑洗脱目的蛋白）。A.3猪瘟病毒重组E2蛋白制备A.3.1载体构建5T/CVMA244—2025以猪瘟病毒C株（GenBank：AF531433）E2基因为表达目的基因的参考序列，合成昆虫细胞密码子优化的基因，将目的片段克隆到pFastbac启动子骨架上，连接His，便于纯化。A.3.2转化杆粒采用42℃水浴热激90s的方法转化DH10Bac感受态细胞，加入1ml无抗LB摇菌4h~5h。A.3.3菌落鉴定取50μL复苏后的菌液均匀地涂抹到LB平板（50μg/mLKan，7μg/mLGentamicin，7μg/mLTetracycline，40μg/mLX-gal，40μg/mLIPTG）上，倒置于37℃的恒温培养箱培养48h至蓝白分明。挑3个白色的克隆，重新划线在LB平板（50μg/mLKan，7μg/mLGentamicin，7μg/mLTetracycline，40μg/mLX-gal，40μg/mLIPTG）上，37℃过夜培养。用PCR方法进行鉴定，引物为M13F：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'，M13R：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'，目的片段长度为3500bp。A.3.4Bacmid提取用质粒提取试剂盒提取含有目的基因的Bacmid。A.3.5转染昆虫细胞将Bacmid转入昆虫细胞sf9，置于28℃恒温培养箱中，培养4d~5d。待细胞明显膨大、细胞中出现黑色小颗粒、细胞生长明显受到抑制等现象出现，收集上清，即为第一代含有目的基因的重组杆状病毒P1。将病毒液在Sf9细胞上传3代后，以1%的比例感染Sf9细胞。28℃培养96h后，收集培养上清。A.3.6蛋白纯化将收集的培养上清12000r/min离心10min，收集上清，用离心超滤法浓缩。浓缩的上清在镍离子亲和层析洗液（50mmol/L磷酸钠、300mmol/L氯化钠，pH7.0）中4℃透析过夜。平衡过的上清加入镍离子亲和层析柱，4℃吸附30min后，用40mmol/L咪唑洗脱，收集洗脱液。用SDS电泳检测纯化效果。A.4猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白制备以PRRSVCH-1R毒株结构蛋白N的基因序列（GenBank号：AAC15449.2）为参考，在N基因序列（372bp）5′端添加His和S标签序列，并对原核表达密码子进行优化，委托基因合成公司合成重组表达质粒pET28a-PRRSV-N。经BamHⅠ+NotⅠ双酶切鉴定并进行测序验证。按质粒转化步骤在冰上将重组质粒pET28a-PRRSV-N转化至BL21（DE3）感受态细胞，涂布于含50mg/L卡那霉素的固体LB培养基上，37℃培养12h，挑取阳性单克隆菌落接种于含50mg/L卡那霉素的液体LB培养基中，37℃、220r/min培养2h~4h，当菌液OD600nm值达到0.6~0.8时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导目的蛋白表达。4500r/min离心30min收集菌体。PB缓冲液重悬菌体，冰浴超声，高速离心分离上清和沉淀，用等体积的8mol/L尿素溶解沉淀，SDS鉴定分析。6T/CVMA244—2025口蹄疫、非洲猪瘟、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体联检胶体金免疫层析试纸条制备B.1口蹄疫O型病毒抗体胶体金免疫试纸条的制备B.1.1胶体金溶液制备取1%氯金酸水溶液1mL加蒸馏水至100mL制成0.01%氯金酸水溶液，加热至沸腾，加入不同1.5mL1%（w/v）柠檬酸三钠水溶液，继续煮沸，直至液体变为酒红色，冷却备用。B.1.2免疫胶体金（1）的制备用0.02mol/LK2CO3溶液调节pH至7.5，按1.1μg/mL最佳标记量加入口蹄疫O型病毒纯化抗原146S，磁力搅拌40min，加入100g/LBSA至终浓度为10g/L，磁力搅拌30min。10000r/min离心40min，弃上清，将沉淀用金胶缓冲液悬浮溶解，备用。B.1.3免疫胶体金（2）的制备用0.02mol/LK2CO3溶液调节pH至8.5，按4μg/mL最佳标记量加入兔抗IgG，磁力搅拌40min，加入100g/LBSA至终浓度为10g/L，磁力搅拌30min。10000r/min离心40min，弃上清，将沉淀用金胶缓冲液悬浮溶解，备用。B.1.4免疫胶体金玻璃纤维膜制备将免疫胶体金（1）与（2）以8﹕2混合，喷涂到长270mm、宽10mm的玻璃纤维垫上，37℃干燥30min，得到金标垫。B.1.5含有C线和T线的硝酸纤维素膜的制备将口蹄疫O型病毒纯化抗原146S调整至0.2mg/mL，羊抗兔抗体调整至0.2mg/mL的工作浓度，分别喷涂于硝酸纤维素膜上，形成T线与C线，37℃干燥30min，保存备用。B.1.6试纸的组装在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸，按照要求切割成长不大于60mm，宽不小于3.8mm的试纸，即制成口蹄疫O型病毒抗体胶体金免疫层析试纸。B.2非洲猪瘟病毒抗体胶体金免疫试纸条的制备B.2.1免疫胶体金（1）的制备用0.02mol/LK2CO3溶液调节pH至9.0，按2.7μg/mL最佳标记量加入非洲猪瘟病毒重组p30蛋白，磁力搅拌40min，加入100g/LBSA至终浓度为10g/L，磁力搅拌30min。10000r/min离心40min，弃上清，将沉淀用金胶缓冲液悬浮溶解，备用。B.2.2免疫胶体金（2）的制备B.2.3免疫胶体金玻璃纤维膜制备7T/CVMA244—2025B.2.4含有C线和T线的硝酸纤维素膜的制备将非洲猪瘟病毒重组p30蛋白调整至0.1mg/mL，羊抗兔抗体调整至0.2mg/mL的工作浓度，分别喷涂于硝酸纤维素膜上，形成T线与C线，37℃干燥30min，保存备用。B.2.5试纸的组装在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸，按照要求切割成长不大于60mm，宽不小于3.8mm的试纸，即制成非洲猪瘟病毒抗体胶体金免疫层析试纸。B.3猪瘟病毒抗体胶体金免疫试纸条的制备B.3.1免疫胶体金（1）的制备用0.02mol/LK2CO3溶液调节pH至7.5，按34μg/mL最佳标记量加入猪瘟病毒重组E2蛋白，磁力搅拌40min，加入100g/LBSA至终浓度为10g/L，磁力搅拌30min。10000r/min离心40min，弃上清，将沉淀用金胶缓冲液悬浮溶解，备用。B.3.2免疫胶体金（2）的制备B.3.3免疫胶体金玻璃纤维膜制备B.3.4含有C线和T线的硝酸纤维素膜的制备将猪瘟病毒重组E2蛋白调整至0.57mg/mL，羊抗兔抗体调整至0.2mg/mL的工作浓度，分别喷涂于硝酸纤维素膜上，形成T线和C线，37℃干燥30min，保存备用。B.3.5试纸的组装在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸，按照要求切割成长不大于60mm，宽不小于3.8mm的试纸，即制成猪瘟病毒抗体胶体金免疫层析试纸。B.4猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体胶体金免疫试纸条的制备B.4.1免疫胶体金（1）的制备用0.02mol/LK2CO3溶液调节pH至7.5，按4μg/mL最佳标记量加入猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白，磁力搅