种子的扩大培养

种子的扩大培养演示文稿1第1页，共20页。（优选）种子的扩大培养第2页，共20页。3◆种子及发酵级数孢子(或菌丝)接入到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝——一级种子；把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更多的菌丝——二级种子；将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。使用三级种子的发酵，称为四级发酵。第一节

基本概念◆种子培养指提供给种子适宜的生长繁殖条件，使种子能够迅速生长成合格的菌体的过程。

◆种子的扩大培养休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量纯种的过程。第3页，共20页。4

◆接种将孢子或菌落，或试管、三角瓶或种子罐中菌体接入培养容器的操作过程。

◆接种量移种的种子液体积和培养液体积之比。

◆接种龄种子罐中培养的菌体开始移种到下一级种子罐或发酵罐的培养时间。双种法

2个种子罐的种子接人1个发酵罐的接种方法。倒种法

以适宜的发酵液倒出部分对另一发酵罐作为种子的接种方法。混种法

以种子液和发酵液混合作为发酵罐的种子的接种方法。第4页，共20页。5

种醪

接入至种子罐中的种子经培养后所得的含有一定菌体浓度的种子液。

专性好气菌只有在空气或氧O2存在的条件下才能生长的菌体，氧为呼吸过程中的最终受氢体。

专性厌气菌只有在没有空气或无氧条件下才能生长的菌体，分子态氧对它们有毒害作用，如丙酮丁醇梭状芽孢杆菌。

兼性好气菌或兼性厌气菌既能在空气或有氧条件下生长，又能在没有空气或缺氧条件下生长的菌体。包括酵母菌及部分细菌。第5页，共20页。6第二节种子培养过程

包括：孢子制备过程，种子制备过程

一、种子制备工艺

——实验室阶段和种子罐生产培养阶段1．实验室种子制备（1）斜面种子培养活化菌种，同时也培养一定数量的斜面种子。（2）液体培养包括液体试管和三角瓶摇床震荡或回旋式培养。①液体试管培养

无菌条件下，用接种针自斜面试管挑取一环斜面种子菌体，接入装有液体培养液的试管，摇匀后，置培养箱培养，待培养成熟后，再接入三角瓶培养。②三角瓶液体培养（摇瓶种子）第6页，共20页。7第7页，共20页。82.生产车间种子制备☆（1）种子罐级数的确定

指制备种子需逐级扩大培养的次数。

◆种子罐级数主要决定于菌种的生长特性，孢子发芽及菌体生长繁殖速度，以及所采用的发酵罐容积。

◆种子制备目的形成一定数量和质量的菌体。孢子发芽和菌体开始繁殖时，菌体量很少，在小型罐内即可进行。

◆发酵目的获得大量的发酵产物。产物是在菌体大量形成并达到一定生长阶段后形成的，需要在大型发酵罐内才能进行。同时许多发酵产物的产生菌，其不同的生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。第8页，共20页。9◆生长缓慢的菌种，如果没有经过多级种子扩大培养就接种到发酵罐，将延长发酵周期，使生产能力下降。进行多级种子扩大培养后再移种至发酵罐是工业化生产所必须的。◆种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并减少由于多次转种而带来的染菌机会。第9页，共20页。10种子罐工艺控制：①孢子量；②罐温；③罐压；④通气量；⑤搅拌⑥pH、离心等参数控制；⑦种龄；⑧培养基；⑨灭菌及降温时间第10页，共20页。11☆（2）接种量的确定

◆与该菌在发酵罐中生长繁殖的速度、种子质量和发酵条件等有关。

a.接种量过多，菌丝生长过快、过稠，培养液粘度增加，营养基质缺乏或溶解氧不足，影响产物的合成。

b.接种量过小，引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期延长，菌丝量少，还可能产生菌丝团，导致发酵异常。生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施

多数抗生素发酵接种量为7％～15％，有时可加大到20％～25％。☆（3）接种龄的确定接种龄以处于生命力旺盛的对数生长期的菌丝最为合适，实验确定。第11页，共20页。12

（4）种子质量的判断方法测定的参数有①

pH；②培养基灭菌后的糖、氨基氮、磷的含量；③菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观(色素、颗粒等)；④其他参数。如转种前的抗生素含量、某种酶活力等。第12页，共20页。13（5）种子质量的控制措施①菌种稳定性检查定期考察和挑选菌种；对菌种进行自然分离；摇瓶发酵，测定其生产能力，从中挑选具有较高生产能力的高产菌株。②适宜的生长环境包括营养丰富的培养基、适宜的培养温度和湿度、合理的通气量等。③种子无杂菌检查每移种一步均需要进行无菌检查，并对种子液进行生化分析。第13页，共20页。14米孢子质量①无菌状况必须保证（无菌室操作，无菌样监测，无菌室的管理，灭菌锅温度和压力的校验）②菌落形态的挑选③原材料的质量保证（玉米浆/小米等有机氮源质量易波动，产地/厂家/摇瓶）④培养基（配方，灭菌，孢子数量需求）⑤接种量适当⑥培养过程温度和湿度（空调及恒温恒湿机的保障）⑦培养时间第14页，共20页。15种子罐生长的好坏①无菌状况必须保证（罐体本身、各系统设备及管线的灭菌）②培养基（配方，灭菌及降温过程）③原材料质量的稳定（玉米浆/蔗糖及无机盐的质量控制）④接种孢子数量控制⑤工艺控制：罐温；罐压；空气；pH；搅拌；离心量；移种周期控制第15页，共20页。163．接种方法（1）压差接种

利用两端压力差，液体从高压流向低压的接种方法。①孢子悬液接种

②种醪接种

（2）注射接种

用于种子罐接种，在罐顶接种管口压盖一层橡胶膜，将注射器针嘴插入橡胶膜进行接种。（3）摇瓶直接进罐法

适合种子罐接种，一般需三人配合操作。第16页，共20页。17二、注意事项

（1）按照无菌操作（2）消毒灭菌一定要彻底、干净（3）在接种操作中，一定要严格按照无菌操作进行，规范生产操作，严禁误操作带来的杂菌污染，经常提醒，建立严格的无菌概念，避免出现二次污染。（4）生产中使用的斜面菌种不宜多次移接，一般只移接三次(三代)，以免由于菌种的自然变异引起菌种不纯。因此，要经常进行菌种的分离纯化，不断提供新的斜面菌株供生产使用。（5）按不同菌种的不同生理特征，选用不同的工艺来生产发酵所用的种子。即使是相同的发酵生产，也要根据本单位的具体条件对工艺操作方法加以调整。

第17页，共20页。18（6）在种子制备过程中，要特别加强对影响种子质量的各种因素的调控。（7）对已有的优良生产品种的菌种，要采取相应的方法，使其在尽量长的时间内保持生产性能稳定、死亡率低、变异少。（8）已经退化的菌种，要及时进行分离纯化，通过复状，恢复菌种的优良性能。（9）种子通过接种管道进行移种时，移种过程中要防止接受罐表压降至零，否则会引起染菌。第18页，共20页。19第三节问题分析及处理手段☆一、种子培养过程中影响因素1．孢子培养过程中的影响因素（1）原材料质量无机离子（如微量元素Mn2+、Cu2+、Ba2+）能刺激孢子的形成，磷含量也会影响孢子的质量。（2）培养温度过低菌种生长发育缓慢；过高菌体代谢活动加快，缩短培养时间，使孢子成熟早，易老