【大米中镉体外生物利用率实验探究报告9700字】

大米中镉体外生物利用率实验探究报告目录TOC\o"1-3"\h\u31998大米中镉体外生物利用率实验探究报告 1309481.1引言 1249911.2材料与仪器 222621.1.1主要材料与试剂 2191811.1.2主要仪器与设备 324641.3实验方法 3312491.3.1样品采集与预处理 3125031.3.2体外模拟消化过程 428571.3.3细胞培养 5316041.3.4细胞单层模型的形态学观察 6315511.3.5细胞模型的验证 6241991.3.6细胞转运实验 7201361.3.7样品中镉的测定 8108891.3.8样品中镉的体外生物利用率计算 9254791.3.9健康风险评估 977751.3.10数据处理与分析 964781.4结果与讨论 10202961.4.1大米样本中镉含量分布 10321201.4.2Caco-2细胞形态学观察： 11300171.4.3Caco-2细胞模型的验证 12283611.4.4大米中镉的体外生物利用率测定 14265491.4.5健康风险评估 17296571.5讨论 181.1引言在进行化学危害物人体健康风险评估时，需要得到准确的污染物暴露剂量，因此常常会使用到生物利用率作为其中一个评估因子。人源结肠癌上皮细胞(Caco-2细胞)在体外培养条件下能自发进行上皮样分化，形成紧密联结的细胞单层，由于其分化特性、形态特征、标志酶的功能表达及渗透特征等与小肠非常类似，因此可以满足体外模拟消化吸收实验的需要。随着体外消化模型的不断发展，Caco-2细胞与体外消化模型联合使用逐渐成为评估食品中重金属、矿物质和生物活性成分等经口生物利用率的新方法[62]ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>杨秀伟</Author><Year>2007</Year><RecNum>109</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[62]</style></DisplayText><record><rec-number>109</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rrtrfvxzvvdfd0ersv4xafzlxfretadvwrvx"timestamp="1617774293">109</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>杨秀伟</author><author>杨晓达</author><author>王莹</author><author>马莲</author><author>张悦</author><author>杨晓改</author><author>王夔%JJournalofIntegrativeMedicine</author></authors></contributors><titles><title>中药化学成分肠吸收研究中Caco-2细胞模型和标准操作规程的建立</title></titles><pages>634-641</pages><volume>5</volume><number>6</number><dates><year>2007</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>。与动物实验相比，在评估镉污染大米的健康风险时，这一方法具有简便省时，成本低廉，重复性好等优势。本章选用了102种来自不同产地，污染水平不同的镉大米为研究对象，将大米进行熟制，选用体外消化模型RIVM法，采用三步消化法（口腔、胃部、小肠）进行体外模拟消化，通过测定Caco-2细胞单层模型培养过程中的TEER值、AKP酶在AP侧与BL侧的酶活比以及荧光素钠的Papp值，验证细胞单层的紧密性、极性、通透性后，采用培养好的Caco-2细胞单层模型进行吸收转运实验，最后采用电感耦合等离子体质谱仪(InductivelyCoupledPlasmaMassSpectrometry，ICP-MS)对样品中的镉含量进行测定，以此测定镉的体外生物利用率，最后对不同污染水平的镉大米进行健康风险评估。1.2材料与仪器1.1.1主要材料与试剂不同污染水平的大米全国各地粮油质检站或当地采样Caco-2细胞中国典型培养物保藏中心购买镉标准储备液国家标准物质中心铟标准储备液国家标准物质中心氯化镉(分析纯)国药集团化学试剂有限公司硝酸(MOS级)国药集团化学试剂有限公司RPMI1640培养基美国Gibco公司FBS胎牛血清 美国Gibco公司青-链霉素细胞双抗溶液(100×)美国Sigma公司0.25%胰酶溶液美国Gibco公司PBS缓冲液美国Gibco公司HBSS缓冲液美国Gibco公司荧光素钠盐美国Sigma公司碱性磷酸酶(AKP）试剂盒南京建成生物工程研究所CCK-8试剂盒南京建成生物工程研究所非必须氨基酸溶液美国Gibco公司二甲基亚砜(DMSO)美国Sigma公司TritonX-100美国Sigma公司DAPI美国abcam公司Anti-ZO-1美国abcam公司AlexaFluor488美国abcam公司山羊血清武汉安特捷生物技术有限公司4%PFA武汉安特捷生物技术有限公司其他常用无机盐类试剂(如氯化钾、硫氰酸钾、氯化钠、碳酸氢钠等)、盐酸、氢氧化钠等常用试剂均为国药集团化学试剂有限公司提供的分析纯试剂。1.1.2主要仪器与设备电感耦合等离子体质谱仪NexION350X美国PerkinElmer公司微波消解仪MultiwavePRO奥地利AntonPaar公司赶酸仪（电加热板）上海博通化学科技有限公司超净工作台BBS-V800济南鑫贝西生物技术有限公司CO2培养箱德国Memmert公司数显恒温水浴锅HH-S2金坛市医疗仪器厂离心机TDZ5-WS长沙平凡仪器仪表有限公司酶标仪(EnSpire)美国PerkinElmer公司荧光倒置显微镜IX53奥林巴斯公司1.3实验方法1.3.1样品采集与预处理本实验中，从中国主要大米产区的当地农业机构、零售市场或农田随机采集到了102份稻谷样品，每个地区采集到的水稻样品的具体数量为：云南(n=1)、上海(n=2)、吉林(n=2)、辽宁(n= 3)、江苏(n= 3)、贵州(n= 3)、重庆(n= 10)、安徽(n=8)、湖北(n=15)、福建(n= 5)、四川(n= 3)、广西(n= 7)、广东(n= 6)、湖南(n= 21)、江西(n=13)。采样地区分布如图1.1所示。图1.1稻谷样品采集地区分布将所有谷物样品经砻谷脱壳后，得到糙米样品，然后将糙米以2800r/min的速度放入碾米机，碾压加工90秒，得到二级精米。最后将得到的共102份大米样品存放在4℃聚乙烯瓶中等待后续试验。称取50克大米置于烧杯中，用超纯水淘洗3次，然后加入用100ml超纯水(1:2的比例)，放入电饭煲中加热至水分完全蒸干。将煮熟的大米样品置于60℃烘箱中烘干48h，再用万能粉碎机磨成细粉，经均质处理后，通过0.25mm目筛(50目筛)。最后将所有的大米粉样品都保存在密封的塑料袋中，4℃保存，等待后续的体外模拟消化实验。1.3.2体外模拟消化过程选取RIVM法制定模拟消化过程如下：口腔：准确称取米样0.5g于离心管中，加入7mL唾液，调整pH至6.8，置于37°C摇床中反应5min；胃部：向口腔模拟消化结束的样品中加入14mL胃液，调整pH至1.3，置于37°C摇床中反应2h；肠道：向口腔模拟消化结束的样品中加入21mL消化液(14mL肠液+7mL胆汁)，调整pH至8.1，置于37°C摇床中反应2h。摇床设置速度均为每分钟150转。将大米粉样品按照上述条件进行消化后，立即取出降温至0℃。然后将离心管置于低速离心机中进行离心（2900r/min，5min），分离上清液（即消化液）和沉淀（即食糜），将上清液用0.22μm滤膜进行过滤后，两者均放置于4℃冰箱冷藏保存。表1.1消化液配方(基于1000mL体系配置)唾液胃液十二指肠液胆汁896mgKCl2752mgNaCl7012mgNaCl5259mgNaCl200mgKSCN306mgNaH2PO4·H2O3388mgNaHCO35785mgNaHCO31021mgNaH2PO4·H2O824mgKCl80mgKH2PO4376mgKCl570mgNa2SO4302mgCaCl2564mgKCl150μLHCl(37%)298mgNaCl306mgNH4Cl50mgMgCl2·6H2O250mg尿素1694mgNaHCO36.5mL37%HCl180μLHCI(37%)167.5mgCaCl2200mg尿素650mg葡萄糖100mg尿素20mg葡萄糖醛酸151mgCaCl285mg尿素330mg盐酸葡萄糖胺290mg淀粉酶lg牛血清白蛋白lg牛血清白蛋白1.8g牛血清白蛋白15mg尿酸1.5g胃蛋白酶9g胰酶30g胆汁25mg粘蛋白3g粘蛋白1.5g脂肪酶超纯水超纯水超纯水超纯水1.3.3细胞培养(1)细胞复苏：从液氮罐取出Caco-2细胞，在37℃水浴锅中轻轻摇晃直至融化，然后将冻存管液体转移至离心管中，加入10倍以上体积的完全培养基(含RPMI1640培养基、10%胎牛血清、1%双抗溶液、1%非必须氨基酸溶液)，1200r/min下离心5分钟后弃去上清，加入2ml完全培养基重悬，最后将细胞悬液接种于10cm2的培养瓶中，再加入3ml的完全培养基。于37℃的CO2培养箱中培养24h后，更换培养基，此后每日观察细胞的生长状况，隔日换液。(2)细胞传代：当观察到培养瓶细胞生长融合达70%以上时，即可进行传代。传代步骤为：先弃去培养瓶中的培养基，然后使用37℃预热的PBS溶液轻轻清洗细胞两次，弃去液体，加入0.25%的胰酶消化1-2分钟，弃去培养瓶中的液体，加入5mL完全培养基把细胞吹打下来。然后吸取细胞悬液于15mL离心管中，1200r/min下离心5min后，弃去上清液，加入新的培养基重悬细胞，转移至新的培养瓶中，继续培养，当观察至细胞活力明显上升，生长速度极快时，即可用于转运实验模型建立。本实验中使用的Caco-2细胞代数约为10-20代。(3)Caco-2细胞单层模型建立：正常进行传代操作后，取细胞悬液进行细胞计数，将细胞浓度调整到1.5×105个/mL后接种在Corning3460transwell培养板中，在每个小室上侧AP侧(Apicalside)加入0.5mL细胞悬液，基底侧BL侧(Basolateside)加入1.5mL完全培养基，接种24h后更换培养基，1周内隔天换液，之后根据细胞生长状态不同，1-2日换液，细胞培养总周期为21天。1.3.4细胞单层模型的形态学观察将Caco-2细胞接种到Transwell培养板后，分别在培养至第7、14、21天时取出培养板，将荧光倒置显微镜调至合适倍数进行观察、拍照保存。每次观察完后，将培养板表面喷酒精，轻轻擦拭缝隙，经消毒处理后，放入CO2培养箱中继续培养。1.3.5细胞模型的验证(1)细胞单层膜结构鉴定紧密连接是一种最为重要的细胞间连接方式，其主要作用是封闭相邻细胞间的接缝，防止溶液中的分子沿细胞间隙渗入体内，从而保证了机体内环境的相对稳定[63]，因此使用相应抗体对细胞模型进行免疫组化，是观察细胞模型结构的常用手段。在本实验中，选择对Caco-2细胞间的紧密连接蛋白ZO-1进行免疫组化，以确定形成了紧密性好的细胞单层结构。具体操作步骤如下：细胞固定：在Caco-2细胞接种于transwell板并培养至第21天后，取出transwell板，吸取两侧的培养基，用37℃下预热的PBS分别清洗上下室3次，然后用4%(w/v)的多聚甲醛溶液固定细胞10分钟，然后再次使用PBS清洗3次。吸去PBS，加入封闭液(5%山羊血清、0.1%TritonX-100，基底液为PBS缓冲溶液)，封闭1小时。免疫组化：弃去封闭液，加入一抗(兔抗人，紧密蛋白ZO-1抗体，溶解于封闭液溶液中)，然后置于37℃环境中孵化2小时，用PBS清洗3次，吸去PBS。最后在室温下，加入二抗(AlexaFluor®488羊抗兔IgG二抗，溶解于封闭液中)在避光条件下孵化1小时,用PBS清洗2次，吸去PBS，加入DAPI一起孵化10分钟，用于细胞核染色，用PBS清洗3次，在此过程中，每次使用PBS清洗后，至少间隔3分钟再进行下一次清洗。最后使用荧光倒置显微镜在激发波长488、405分别对孵化好的Transwell板进行观察并拍照。(2)细胞单层功能指标测定紧密性：使用MillicellERS-2跨膜电阻仪，通过测定细胞单层的跨膜电阻值(Transepithelialelectricalresisitance,TEER)，以此确定细胞单层模型的完整性和紧密度。具体操作步骤为：在测定前，先将电极浸泡于75%酒精中10min达到灭菌的目的，取出transwell板，置于超净台内，室温静置10min，然后将风干后的跨膜电阻仪的电极短端插入转运板小室的AP侧，长端插入BL侧，读取电阻值，分别于分别在细胞培养的第4、8、12、16、21天进行测定，每板取三个孔，同时测定未接种细胞的培养板电阻值作为空白对照。计算公式如下：TEER(Ω·cm2)＝(样品孔电阻值－空白孔电阻值)×膜面积(1.1)公式(1.1)中：转运板单个小室的膜面积为1.1cm2，电阻值单位为Ω。分化极性：碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,AKP)是小肠上皮细胞刷状缘酶的标志物，细胞在单层形成过程中可以产生AKP，通过分别测定膜两侧的AKP活性来定位AKP主要集中在哪一侧，从而在一定程度上反映细胞的极化程度。采用AKP试剂盒分别在4、8、12、16、21天收集transwell模型中AP和BL两侧的培养基，分别测定其AKP酶活性，并计算二者比值，即AP/BL，差值越大表明细胞分化的程度越高。通透性：用HBSS缓冲液配制浓度为80μg/mL的荧光素钠母液，然后稀释为0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL和8μg/mL的标准溶液。分别取各浓度标准溶液200μL于96孔板中，以HBSS缓冲液作空白对照。使用酶标仪在吸光度490nm处测定其OD值，以此绘制出荧光素钠浓度-OD值标准曲线。将培养21天后的Caco-2单层细胞，用37℃预热的HBSS轻轻冲洗2次后换液，每板选取1-2孔，在transwell板的AP侧加入0.5mL的荧光素钠溶液(4μg/mL)，BL侧加入1mL不含荧光素钠的纯HBSS缓冲液，置于培养箱2h后，吸取200μL的BL侧液体测定490nm处的吸光值。最后通过计算荧光素钠的渗透率来检测细胞单层的通透性。通过测定荧光素钠从AP侧向BL侧的被动扩散表观渗透系数(Theapparentpermeabilitycoefficients,Papp)来反映整个细胞单层膜的通透性。Papp(cm/s)=(dC/dt)×V/(A×C0)(1.2)公式(1.2)中：dC/dt：单位时间内的转运量(μg/s)；V：BL侧溶液体积(1.5mL)；A:细胞单层膜面积(1.12cm2）；C0：AP侧初始浓度(μg/mL)。1.3.6细胞转运实验将培养时间达到21天、各项指标符合要求的Caco-2细胞模型取出，小心吸取transwell板小室AP侧和BL侧的培养基，然后用37℃预热的HBSS缓冲液轻轻清洗2次后换液。取出冰箱中的消化液滤液，调整其pH到7.4，并加入HEPES缓冲盐使其终浓度为10mM以维持pH,再次过膜，然后置于37℃水浴10min，吸取滤液0.5mL加入到transwell板的AP侧，再加入1.5mL的纯HBSS溶液到BL侧，最后将transwell板置于细胞培养箱中，转运时间3h，结束后分别收集AP侧和BL侧溶液，用于ICP-MS测定。1.3.7样品中镉的测定(1)样品的前处理：称取0.2g的样品(液体1ml)于聚四氟乙烯消解罐中，加入7mL浓硝酸，密封后置于微波消解仪中设定程序进行消解(消解条件见表1.2)，结束后在通风橱中取下盖子，然后将消解罐放入赶酸仪中，在200℃下加热赶酸约1.5h，期间多观察几次，观察至溶液剩余0.5mL左右时，取下消解罐，然后加入少量的2%硝酸溶液润洗，将其转移到离心管中，最后用2%硝酸溶液定容至25mL。表1.2微波消解条件步骤温度/℃时间/min温度爬坡13010温度保持1305温度爬坡20010温度保持20020冷却7020(2)ICP-MS检测条件与步骤：在开机之前，确认仪器供电系统正常，打开氩气阀门，开机后点击抽真空，待真空状态达到1×e-7Torr以下时，开启冷却循环水，打开氦气阀门，点炬，然后对仪器参数相关参数进行监测，确认仪器处于正常状态；每次测定前，先采用调谐液对仪器进行调谐；优化完成后建立方法，本实验对镉含量测定时，选用KED碰撞模式下，内标采用铟元素(50μg/L)，具体工作条件如下：表1.3ICP-MS工作条件名称参数雾化器气流量(NebulizerGasFlow)0.92L/min辅助气流量(AuxiliaryGasFlow)1.2L/min等离子体气流量(PlasmaGasFlow)18L/minRF功率(ICPRFPower)1300W载气(CarrierGas)Ar碰撞反应池气体(KEDGas)He碰撞反应池气体流量(KEDCellGasA)5mL/min1.3.8样品中镉的体外生物利用率计算样品消化液在Caco-2模型转运实验中，被细胞转运吸收的镉总量占食品中镉总量的百分比即为镉的体外生物利用率，计算公式如下：镉的体外生物利用率(%)=[1-(CAP×VAP)/(FAP×KAP)]×100%(1.3)公式(1.3)中：CAP：转运结束后AP侧镉的质量浓度(μg/mL)，VAP：AP侧溶液的体积(mL)；FAP：大米中镉的质量浓度(mg/kg)，KAP：转运实验中加入食品质量(kg)。1.3.9健康风险评估为明确镉污染大米对人体长期潜在危害，本实验中采用了美国环境保护署(USEnvironmentalProtectionAgency,USEPA)制定的每日预估摄入量(establisheddailyintake,EDI)和目标危险商值(targethazardquotient,THQ)来进行健康风险评估。计算公式如下：EDI=RC×BCBW(1.公式(1.4)中：RC：大米日摄入量(成人为389g，儿童为277g)；BC：摄入大米中Cd的浓度(μg/g)；BW:我国居民的平均体重(成人为60kg，儿童为31.5kg)。THQ=EＦ×ED×EDIRfD×AT×10-3公式(1.5)中：EF：暴露频率(365天)；ED：暴露时长(70年)；AT：平均暴露时间(365天×70年)；RfD：口服参考剂量(1×10-3mg/kg/天)。如果THQ<1，则表示大米中的重金属镉对人体没有明显健康风险；如果THQ≥1，则表示有潜在的健康风险。1.3.10数据处理与分析实验得到的各数据均采用MicrosoftofficeExcel2016软件和IBMSPSSStatistics19进行计算分析，最终采用GraphPadPrism8进行作图。1.4结果与讨论1.4.1大米样本中镉含量分布本研究共采集分析了中国各粮食产区15个省共计102份大米样品，检出率为100%，检测结果经统计分析列举于表1.4，在所有样品中，共有45种大米样品中的镉浓度超过了GB2762-2017中对于大米中镉含量的限制(0.2mg/kg)，镉含量最高的大米样本收集于江西，其含量为1.4710mg/kg，镉含量最低的大米样本收集于上海，其含量为0.0123mg/kg，所有大米样品中镉含量平均为0.2840mg/kg，中位数为0.1771mg/kg，主要分布在0.0977-0.4549mg/kg区间(P10-P90)。表1.4不同产地的大米中镉含量情况省份(n=15)样本量/份镉含量(mg/kg)镉超标率(%)范围均值中位数云南10.04110.04110.04110.00上海20.0123-0.09770.05500.05500.00吉林20.0219-0.11520.06860.06860.00辽宁30.0256-0.04970.03600.03270.00江苏30.0241-0.12730.06930.05670.00贵州30.1677-0.18100.17530.17710.00重庆100.1345-0.23950.16340.159110.00安徽80.0169-0.2220.14530.148111.50湖北150.0187-0.41330.14560.133313.30福建50.1120-0.41130.18010.129620.00四川30.1318-0.26800.19390.181933.30广西70.0745-0.30790.21330.242345.86广东60.1297-0.30710.21820.218550.00湖南210.1617-1.25360.42060.399895.20江西130.2009-1.47100.74910.3997100.00共计1020.0123-1.47100.28400.177144.11按照这些省份的地理分布划分为以下五个区域：东部地区(包括江苏、安徽、江西)：样品共26个；中部地区(包括湖南、湖北)：样品共36个；南方地区(包括广东、广西、福建)：样品共18个；东北地区(包括辽宁、吉林)：样品共5个；西南地区(包括云南、贵州、四川、重庆)：样品共17个。绘制各地区大米样品中镉含量分布散点图如图1.1所示。图中的横线表示平均值，不同字母表示组间存在显著性的差异(p<0.05,n=102)。比较不同地区中样品的含量后结论如下：中国东北、正东部、中部、正南部和西南地区收集到的大米样品中镉的平均含量分别为0.0490,0.4315,0.3060,0.2057和0.1637mg/kg。从平均水平上看，大米样品中镉浓度最低的地区是东北地区，最高的地区是正东部地区。同时经过统计学分析比较后发现，这两组地区收集到的大米中镉的含量数据存在显著性差异(p<0.05)。同时，值得注意的是，即使是在同一地区采集的样品，镉含量也会有很大的差异，这可能是由于同一地区不同采样点的污染水平不同造成的[64]。例如，在东部地区所采集的大米样品中，镉含量最高的大米其含量为最低含量的200.89倍。从趋势上看，本次收集到的大米中的镉含量，从地区上呈现由南到北、由东到西的递增趋势。综上所述，大米的含量测定结果说明本研究所选的采样点中，东部粮食产区所受镉污染情况最为严重，东北地区镉污染程度最低，这可能与这些地区工业化程度的差异有关[65]。图1.2不同地区的大米的镉含量注：不同字母表示在p<0.05的水平下有显著性差异1.4.2Caco-2细胞形态学观察：分别在细胞培养至第2、7、14、21天用倒置显微镜观察Caco-2细胞单层状态并拍照(100×)。从图1.3可以看出细胞在刚刚接种在Transwell小室上时，细胞均匀的散落在膜上，细胞轮廓呈圆形。培养一周后，细胞数量显著增加，基本铺满了整个小室底部，且细胞逐渐由散落分布变为聚集分布，细胞轮廓由第一天的圆形变成不规则形状，依然能观察到清晰的细胞边界，培养两周后，细胞连接更为紧密，部分细胞已经观察不到清晰的边界，说明细胞已经开始分化，培养三周后，细胞单层结构上呈现出一块块地“大理石”形状，同时还可发现小片的阴影团状物，这可能是由于分化后的细胞在细胞单层膜的外侧分泌了一定粘液，形态学观察结果表明，细胞在经过21天的生长分化后，形成了致密的肠道单层上皮细胞结构，在形态上满足实验要求。图1.3Caco-2细胞单层形态随培养时间的变化情况注：ABCD分别表示细胞培养至第2、7、14、21天的生长状态1.4.3Caco-2细胞模型的验证(1)细胞间紧密连接蛋白ZO-1结构鉴定如图1.4所示，蓝色点装结构表示Caco-2细胞的细胞核，绿色絮状物表示紧密连接蛋白ZO-1，可以看到Caco-2细胞在细胞间边界形成了明确的紧密连接蛋白ZO-1(绿色)。结合形态学观察结果来看，经过21天后，Caco-2细胞已经均匀的分布在Transwell板的小室膜上，并且由致密的紧密连接蛋白ZO-1相互联结，说明体外培养的Caco-2细胞分化形成了紧密结合的细胞单层结构。图1.4Caco-2细胞单层的细胞核和紧密连接蛋白ZO-1注:A、B分别表示观察到的ZO-1蛋白和细胞核，C为两者的叠加图(2)TEER值测定一般TEER值≥200Ω/cm2可以认为细胞单层的紧密性和完整性较好，通常标准培养模型范围在200-700Ω/cm2之间。如图1.5所示，随着培养时间的增长，总体上，受试孔的TEER值逐渐升高，在第21天进行测定所得结果显示，TEER值达到625Ω/cm2，表明此时形成了完整、紧密的细胞单层，符合实验要求。图1.5Caco-2细胞的TEER值与生长时间的关系(n=5,mean±SD)(3)细胞单层极性测定如图1.6所示，AP侧与BL侧AKP酶活比从第4天开始已经缓慢升高，12天后急剧升高，到第21天最终达到了1.4:1，说明AKP酶已经主要集中于AP侧(刷状缘侧)，建立的细胞模型极化状态以满足转运实验需求。图1.6Caco-2细胞膜两侧(AP/BL)AKP酶活比与生长时间的关系(n=5,Mean±SD)(4)细胞单层通透性测定如图1.7所示，拟合方程后得到标准曲线：Y=0.065X+0.0344(R2=0.9997)，将荧光素钠透过液所测的OD值代入其中后得到BL侧的浓度为0.3778μg/mL，最后根据Papp计算公式可求得荧光素钠的Papp=4.1746×10-7。当表观渗透系数Papp>10×10-6cm/s，表明药物吸收良好；当Papp<1.0×10-6cm/s，表明药物吸收较差。本次实验中采用的荧光素钠为难吸收药物，实验结果符合以上标准，表明Caco-2细胞单层模型的通透性正常，可以用于受试物的吸收转运实验。图1.7荧光素钠标准曲线1.4.4大米中镉的体外生物利用率测定大米中镉的体外生物利用率结果如表1.5。在计算生物利用率时共出现了6个异常值(大于1或为负值)。造成异常值出现的可能原因分别是：大米中的镉含量过高，导致在进行转运实验时，Caco-2单层结构受到了一定的损伤[66]，导致最终计算的结果不准；或大米中的镉含量太低，经过多次稀释后，最终测定的样品中，几乎不再存在有来源于大米的镉[67]。经过多次实验重复后，最终这六个样品被剔除。表1.5不同产地中的大米中镉的体外生物利用率省份(n=15)样本量/份镉含量范围(mg/kg)体外生物利用率(%)云南10.041128.73上海10.097715.20吉林20.0219-0.115221.86±8.03辽宁30.0256-0.049731.47±1.39江苏20.0241-0.127326.55±9.02贵州30.1677-0.181030.3±1.58重庆100.1345-0.239525.85±5.95安徽70.0169-0.22219.25±4.62湖北140.0187-0.413321.1±5.53福建50.1120-0.411320.81±4.72四川30.1318-0.268024.57±5.14广西70.0745-0.307924.04±6.44广东60.1297-0.307125.48±7.33湖南210.1617-1.253625.37±7.92江西110.2009-1.471021.6±8.9共计960.0123-1.471023.94±6.91如表所示，总体上，大米中镉的体外生物利用率平均水平为23.94%，中位数为21.67%，主要分布于14.32-31.47%(P10-P90)区间，测得生物利用率最高的大米样本收集于湖南，为39.73%，其镉含量为0.6121mg/kg；最小值为7.47%，该样品收集自江西，其镉含量为1.6148mg/kg。(1)不同产地与大米中镉的生物利用率相关关系以不同产地进行分组后，计算得到各地区大米样品中镉的生物利用率分布如图1.8所示。计算所得结论如下:中国东北、正东部、中部、正南部和西南地区收集到的大米样品中镉的体外生物利用率均值分别为27.63%,20.98%,24.06%,23.63%和26.58%。结果显示，仅有两组地区(东北和正东部)的大米中镉的生物利用率存在显著性差异，这与大米含量分布中的结果一致。但在镉含量没有显著差异的其他地区之间，样品的生物利用率也没有显著性差异，这说明大米的镉含量对于其体外生物利用率大小存在一定的影响关系。图1.896份大米样品中镉的生物利用率(按地区分组)注：不同字母表示p<0.05下存在显著性差异(2)不同含量区间的大米中镉的生物利用率在剩余的96个样品中，镉含量超过0.2mg/kg的样品共有44个。按照大米中镉含量范围重新分组后，各含量区间下大米中镉的生物利用率分布如图1.9所示，分组依据如下：A组：镉含量低于国家标准，镉含量为(<0.2mg/kg)；B组：超标但不超过国家标准的两倍，镉含量为(0.2-0.4mg/kg)；C组：超过国家标准的两倍，镉含量为(>0.4mg/kg)。每个含量区间(A-C)的大米中镉的体外生物利用率的均值分别是23.22%,24.41%和25.58%,中位数分别是21.13%,25.53%和28.74%。在此分组下，最高浓度组体外生物利用率显著高于最低组(P<0.05)。图1.996份大米样品中镉的生物利用率(按含量分组)与前文中以生产地区分组的结论结合来看，在平均水平下，处于最低剂量区间与最高区间的大米中镉的体外生物利用率之间存在显著性的差异，且每组间的最大值与最小值之间都相差悬殊，这与前文中的结论一致，大米的镉含量可能直接影响到了其体外生物利用率的大小。(3)大米中镉含量与镉的生物利用率的相关关系将样品的镉含量为横坐标，生物利用率为纵坐标绘制散点图，结果如图1.10所示，从整体趋势上看，镉含量位于0.05-0.2mg/kg之间和位于0.2-0.4mg/kg之间的大米，随着含量的上升，其生物利用率也随之上升，在此两区间内，两因素似乎有一定的正相关关系，但低于0.05mg/kg的大米的生物利用率显著高于平均水平，且高于0.6mg的镉大米的生物利用率出现了骤降。图1.10镉含量-体外生物利用率相关关系图为了得到更为准确的相关关系，以含量区间分组后，分别对分组与整体进行相关性分析后结果如图1.11所示。图1.11大米镉含量-体外生物利用率相关关系图(分组后)注：图A-F为按照不同区间划分后的相关关系图，A-F分别表示整体、0-0.05mg/kg区间、0.05-0.2mg/kg区间、0.2-0.