CN114174535B Crispr多靶标检测方法及其试剂盒 （上海吐露港生物科技有限公司）

2022.01.21PCT/CN2020/1045882020.07.24WO2021/013257ZH2021.01.28ActivitiesofCRISPR-C2c2Enable发明提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测2(a)n种向导RNA-报告核酸复合探针，所述的向导RNA-报告核酸复合探针具有如式Ia、Z1为第一茎环结构区，所述Z1中的茎环结构为crRNA茎环结构Z3为向导RNA区，其中所述Z3中包含可以引导Cas蛋白特Z5为带可检测标记的单链待切割核酸，其中，所述的可检测2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的Cas蛋白选自下组：Cas12型、3.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的Cas蛋白选自下组：Cas13a型、3所述的向导RNA-报告核酸复合探针为式IIa为碱基互补配对的氢键。所述的向导RNA-报告核酸复合探针为式IIc为碱基互补配对的氢键。4Z1为第一茎环结构区，所述Z1中的茎环结构为crRNA茎环结构Z3为向导RNA区，其中所述Z3中包含可以引导Cas蛋白特Z5为带可检测标记的单链待切割核酸，其中，所述的可检测为碱基互补配对的氢键；ii)第二容器以及位于第二容器内的Cas蛋白，所述Cas蛋白是具有旁路单链核酸切割v)第五容器以及位于第五容器内的用于反转录的反转录酶和vii)第六容器以及位于第六容器内的用于扩增反应和/或反转录反应的dNTPs和/或用(ii)检测所述检测体系中的向导RNA-报告核酸复合探针是否被Cas蛋白进行切割，所56[0002]利用Cas13或Cas12蛋白的CRISPR诊断方法被誉为下一代检测技术(分别称为白能用于核酸检测是基于它们旁路(或反式)切割的活力，即在人工设计的向导RNA的引导[0004]在一个检测体系中同时检测多个存在靶标的方法和技术对于体外诊断的拓展应7导RNA-报告核酸复合探针具有如式Ia或I8[0047]在另一优选例中，所述Z1的长度为10-300nt，较佳地为19-100nt，更佳地为19-[0056]在另一优选例中，所述Z3中包含可以引导所述Cas蛋白特异性结合靶标核酸分子9[0073]在另一优选例中，所述的靶标DNA包括未经逆转录的DNA或由RNA逆转录或扩增而[0085]在另一优选例中，所述的待检测的靶标核酸分子在所述待检测体系中的浓度为1[0087]在另一优选例中，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1至[0089]在另一优选例中，所述Cas蛋白选自下组：Cas12a、Cas12b、Cas12d、Cas12g、LseCas13a、LbmCas13a、LbnCas13a、CamCas13a、CgaCas13a、Cga2Cas13a、PprCas13a、AspCas13b、PsmCas13b、RanCas13b、PauCas13b、PsaCas13b、Pin2Cas13b、CcaCas13b、[0101]i)第一容器以及位于第一容器内的n种具有如式Ia、Ib、Ic或Id所示结构的向导[0115]ii)第二容器以及位于第二容器内的Cas蛋白，所述Cas蛋白是具有旁路单链核酸[0121]v)任选的第五容器以及位于第五容器内的用于反转录的反转录酶和/或用于转录[0122]vii)第六容器以及位于第六容器内的用于扩增反应和/或反转录反应的dNTPs和/[0128](i)提供如本发明第一方面所述的用于同时检测多种靶标核酸分子的检测体系，[0129](ii)检测所述检测体系中的向导RNA-报告核酸复合探针是否被Cas蛋白进行切[0131]在另一优选例中，所述的待检测的样本包括未经扩增的样本以及经过扩增(或核或Ib所示的向导RNA-报告核酸复合探针。应理解，该术语还包括所述复合探针中Z3和Z5之中Z3和Z5形成配对的状态。发明的复合探针与Cas12a蛋白结合并结合到靶标序列上，此时发夹结构(即Z3和Z5的配对和[0199]在另一优选例中，所述的待检测的靶标核酸分子在所述检测体系中的浓度为1至[0203]i)第一容器以及位于第一容器内的n种如本文所述的向导RNA-报告核酸复合探针[0204]ii)第二容器以及位于第二容器内的Cas蛋白，所述Cas蛋白是具有旁路单链核酸其具有信号放大的作用。[0210](i)提供本发明第一方面所述的用于检测靶标核酸分子的检测体系，并且所述的[0211](ii)检测所述检测体系中的向导RNA-报告核酸复合探针是否被Cas蛋白进行切[0213]在本发明中，所述的待检测的样本包括未经扩增的样本以及经过扩增(或核酸扩所述荧光检测法采用酶标仪或者荧光分光光度计件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLoopB，LAMP反应所用的试剂盒为LAMPKit(NEB)。LAMP反应程序为65℃[0246]以上结果表明，一旦所述检测体系中存在相应的靶标即可检测到对应的荧光信备转录模板。具体是，将配对的寡核苷酸(4μM)在1×PCR缓冲液(TransgenBiotech)中退[0259]5’-TTTTTGAGAAGCTCAACGGGCTTTGCCACCTGGAAAGTGGCCATTGGCACACCCGTTGAAAAATT[0262]在Tris缓冲液条件下(50mMTris-HCl[pH8.3]、75mMKCl、3mMMgCl2)，将板可以激活O157的报告核酸探针的切割。反之，利用酶标仪的检测ROX荧光的结果显示，O157模板不能激活SE的报告核酸探针的切割，而SE模板可以激活SE的报告核酸探针的切[0280]以Cas14a1为例，向导RNA-报告核酸复合探针的结构如图6所示，由tracrRNA和[0285]首先，合成带有Cas14a1的tracrRNA的片段，并克隆至pUC57载体上。再用T7-crRNA-F和Cas14a-tracr-R引物(表6)对进行扩增，并将扩增的产物纯化后用来转录[0289]5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCTTCACTGATAAAGTGGAGAACCGCTTCACCAAAAGCTGTCCCTTAGGGGATTAGAACTTGAGTGAAGGTGGGCTGCTTGCATCAGCCTAATGTCGAGAAGTGCTTTCTTCGGAAAGTAACCCTCGAAACAAATTCATTTTTC-3’，黑体标记的序列为T7启动子序列，其余序列为Cas14a1tracrRNA序列。[0291]在Tris缓冲液条件下(50mMTris-HCl[pH8.3],75mMKCl,3mMMgCl2)，将的产物)和0.5μL的T7核酸外切酶(10Units/μL)，并将反应体系[0005]<150>CN20[0014]gaauuucuacu[0020]aauuucuacuguu[0140]aauuucuacugu