微生态制剂的抗肿瘤研究进展(张昌菊)

恶性肿瘤在我国及全世界的危害

每年新发病例超过1000万年死亡人数超过700万发达国家及我国第一死因每五个人的死因中就有一人是癌症人类防治癌症的进展情况科学高效防癌、治癌是世界级的难题最有效的途径是预防最根本的措施是消除或避免癌症的病因和危险因素WHO:防治癌症分为三级Ⅰ级：三分之一的人可以不患癌症Ⅱ级：通过三早使三分之一的病人得到治愈Ⅲ级：减轻痛苦、改善生活质量，延长生存期寻找更为有效的肿瘤治疗生物制剂是目前研究的热点对多种恶性肿瘤具有明显的直接或间接的抗肿瘤活性与化疗药物具有协同作用或疗效相加作用,二者联合应用在维持肿瘤患者的长期生存方面具有独到之处

SeminarⅠ微生态制剂抗肿瘤作用研究进展三峡大学医学院张昌菊2009.12主要内容微生态制剂抗肿瘤作用的实验研究

直接抑瘤杀瘤作用

间接抑瘤杀瘤作用微生态制剂抗肿瘤作用的临床研究一、直接抑瘤杀瘤作用

体内外的研究表明:微生态制剂可通过调节细胞周期、诱导凋亡、抑制端粒酶的活性等机制直接抑制肿瘤细胞的生长。特别是作为肿瘤靶向治疗的载体受到关注（1.调节细胞周期将一定量的微生态制剂与肿瘤细胞系共培养，发现肿瘤细胞的生长受到明显抑制。乳酪乳杆菌——乳腺癌MCF7细胞乳酸杆菌(HN1和HA8)——骨髓瘤细胞乳酪乳杆菌9018株与鼠李糖乳酪乳杆菌_人膀胱癌MGH、RT112细胞系青春双歧杆菌----食管癌EC109细胞的生长益生元对胃癌细胞的抑制作用大豆低聚糖、低聚木糖、低聚果糖和低聚甘露糖在不同时间对BGC-823细胞的抑制作用。结果：大豆低聚糖、低聚木糖、低聚果糖和低聚甘露糖4种益生元对BGC-823细胞均有一定程度的抑制作用(P<0.05),抑制效果基本呈浓度时间依赖关系大豆低聚糖的抑制效果最强,低聚木糖次之,低聚果糖、低聚甘露糖的抑制效果较弱

2.诱导肿瘤细胞凋亡凋亡是细胞自我结束生命的生理性死亡肿瘤细胞可通过多种机制抵抗凋亡而无限增殖，诱导肿瘤细胞凋亡是控制肿瘤的有效途径。近年来先后有文献报道双歧杆菌可通过调节凋亡有关的基因和酶的活性诱导肿瘤细胞凋亡大肠癌裸鼠移植瘤为动物模型用原位末端标记法、免疫组化法和电镜检测了双歧杆菌治疗组和对照组移植瘤的凋亡细胞以及bcl-2、bax基因的表达水平。结果发现，在电镜下治疗组中凋亡癌细胞呈灶状或弥散分布，而对照组凋亡细胞数量极少。双歧杆菌治疗组和对照组大肠癌移植瘤组织bcl-2蛋白表达率分别为70%和90%，bax基因的表达率分别为100%和40%，说明青春型双歧杆菌可调节移植瘤bcl-2及bax基因的表达,下调bcl-2基因，增加bax/bcl-2的比例，最终诱导肿瘤细胞的凋亡3.抑制端粒酶的活性

端粒酶是一种特殊核糖核蛋白聚合酶，具有逆转录酶活性，能以自身RNA亚单位为模板合成端粒DNA，维持细胞染色体端粒长度，从而稳定染色体。正常体细胞由于缺乏端粒酶活性，其端粒随着细胞分裂逐渐缩短，细胞逐渐老化、死亡，而绝大多数肿瘤细胞中端粒酶重新被激活，使细胞永生化。采用PCR-ELISA法检测了经双歧杆菌的胞壁成分脂磷壁酸（LTA）处理前后的HL-60白血病细胞株端粒酶活性的改变HL-60白血病细胞的生长受到抑制，端粒酶活性明显降低，说明双歧杆菌LTA对HL-60白血病细胞具有生长抑制作用，其机理可能与抑制肿瘤细胞的端粒酶有关。4.肿瘤靶向治疗的载体

肿瘤靶向治疗是肿瘤综合治疗的重要组成部分。但目前存在两个重要的问题需要解决:(1)现有的载体系统缺少组织特异性；(2)基因转染的效率比较低，这在很大程度上制约了肿瘤基因治疗的应用。为了克服这两个难题，需要人工构建新型的、具有特异靶向及高效率转染等特性的载体系统。实体瘤具有低氧代谢区，微生态制剂中的厌氧菌具有趋低氧代谢特性，对实体瘤有良好靶向性，并且能够通过多种机制发挥抗实体瘤作用，从而克服了上述缺点，成为理想的抗肿瘤基因治疗的载体。因此，某些厌氧菌可用于肿瘤治疗或作为肿瘤基因治疗的转移载体。双歧杆菌Yazawa等用活的长双歧杆菌(5×106~6×106个菌/鼠)通过尾静脉注入带有黑色素瘤以及Lewis肺癌的小鼠体内4~7天后将肿瘤组织切片经革兰氏染色，镜下发现肿瘤坏死区周围有许多革兰阳性杆菌，细菌数达6×104个/g

瘤组织；将肿瘤组织匀浆作厌氧菌培养,3天后发现有双歧杆菌生长，而在正常组织中未检测到双歧杆菌内皮抑素基因转染青春双歧杆菌通过尾静脉注射到带有肿瘤的小鼠体内，结果显示双歧杆菌只在肿瘤组织内生长，而在正常组织内没有生长。3H-TdR标记婴儿双歧杆菌进行示踪分析组织培养和组织切片革兰氏染色观察婴儿双歧杆菌的肿瘤组织靶向性。示踪结果表明肿瘤组织内放射性强度持续增强，而正常组织放射性强度则持续减弱；组织培养结果显示婴儿双歧杆菌在肿瘤组织内增殖，组织切片显示瘤组织内有大量革兰氏阳性的条杆状紫蓝色深染区，而正常组织中却没有。Aires等研究发现乳酸杆菌可以很好地表达HPV-16VLPs病毒颗粒。用乳酸杆菌携带VLPs病毒颗粒进行黏膜疫苗治疗宫颈癌。二、间接抑瘤杀瘤作用

1.增强机体抗肿瘤免疫应答2.抑制致癌物质的作用肿瘤免疫监视学说（Burnetin1967）

机体免疫系统通过细胞免疫等机制能识别并特异地杀伤突变细胞，使突变细胞在未形成肿瘤之前即被清除，但当机体免疫监视功能不能清除突变细胞时，则可形成肿瘤。

抗肿瘤免疫效应机制

先天性免疫（非肿瘤特异性免疫）获得性免疫（肿瘤特异性免疫）二者共同参与机体免疫监视和抗肿瘤效应。对于多数免疫原性较强的肿瘤，特异性免疫应答起主要作用；对于免疫原性较弱的肿瘤，非特异性免疫应答可能具有更重要的意义T淋巴细胞NK细胞MΦ细胞DC细胞1T淋巴细胞

CTL:直接杀伤Th：分泌细胞因子（TNF、IFN、IL-2）等2自然杀伤细胞（NK）

直接杀伤；释放细胞因子；参与ADCC;3巨噬细胞(M

)直接杀伤；释放细胞因子；参与ADCC；

APC；4树突状细胞（DC）

抗原呈递作用，又称抗原呈递细胞，APC

细胞免疫

CTL细胞释放穿孔素和颗粒酶杀伤肿瘤细胞机制肿瘤细胞穿孔素Deadtumorcell活化的CD8+T细胞颗粒酶CTL通过FasL-Fas作用诱导细胞凋亡FasLFasTNF活化的CD8+T细胞肿瘤细胞Fas死亡相关区TNFRInactiveprocaspaseActivedcaspaseDeadtumorcell

自然杀伤细胞NK细胞杀伤靶细胞的机制①通过释放穿孔素和颗粒酶引起靶细胞解；②通过Fas/FasL途径引起靶细胞凋亡③释放细胞因子，如NK细胞毒因子和TNF等，通过与靶细胞表面相应受体结合而杀伤靶细胞；④NK细胞表达IgGFc受体，可通过ADCC作用杀伤相应靶细胞。

巨噬细胞介导的抗肿瘤效应

ADCC

非特异性膜受体直接与瘤细胞结合；

Mφ介导的胞毒作用(Mφ-mediatedcytotoxity,MMC)；非特异性吞噬和杀伤；释放细胞毒性单核因子。处理和呈递抗原活化的巨噬细胞通过溶酶体酶直接杀伤可通过分泌细胞因子间接杀伤肿瘤细胞合成和释放NOADCC、调理作用巨噬细胞抗瘤效应杀伤肿瘤细胞肿瘤抗原肿瘤细胞1Mφ分泌TNF-α、NO、反应性氧中间产物及蛋白水解酶，直接杀伤肿瘤细胞。2抗肿瘤抗体与Mφ表面的FcR结合，介导ADCC效应。T3Mφ递呈肿瘤抗原，激活T细胞产生TNF-β、穿孔素等，激活巨噬细胞产生协同杀肿瘤效应。Mφ肿瘤细胞巨噬细胞补体受体Fc受体肿瘤细胞被破坏巨噬细胞免疫功能与肿瘤的发生发展一般认为，当宿主免疫功能低下或受抑时，肿瘤发病率增高，而在肿瘤进行性生长时，肿瘤患者的免疫功能受抑制，两者互为因果，双方各因素的消长对于肿瘤的发生发展与预后具有重要的影响通过调控肿瘤免疫治疗肿瘤的思路免疫平衡状态正相调控负相调控BCG最早用于肿瘤治疗的微生物制剂为牛型结核杆菌减毒活疫苗，具有非特异免疫增强作用，属美国FDA认可免疫制剂它能活化巨噬细胞，增强其吞噬杀伤能力，促进IL-1、IL-2、IL-4、TNF等细胞因子的分泌，增强NK细胞杀伤活性，促进MHCⅡ抗原表达,增强T细胞对使肿瘤抗原的识别,激发其细胞毒作用.临床上，BCG已被用于治疗以下肿瘤1.膀胱内灌注，被认为是治疗浅表性膀胱癌的首选疗法，可有效清除原位癌、术后残留癌细胞，从而预防肿瘤复发；2.对上泌尿道原位癌采用经皮肾造口置管或逆行输尿管灌注BCG，其有效率较高（71%）；3.对恶性黑色瘤患者术前应用BCG瘤内注射，可明显降低截肢后的复发率；4.治疗肿瘤并发症，预防肿瘤发生。近年的研究发现其他正常菌群也可通过提高机体免疫功能来抑制或预防肿瘤的发生。目前对双歧杆菌、乳酸杆菌的抗肿瘤作用研究较多。它们可激活巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞，调节T细胞亚群的分布等而发挥抗肿瘤和免疫调节作用。双歧杆菌脂磷壁酸(LTA)对荷瘤小鼠NK细胞受体NKG2D及其配体的影响黑色素瘤B16荷瘤小鼠为研究对象皮下注射LTAMTT、流式细胞术、RT-PCR方法分别检测经LTA处理后NK细胞杀伤活性、NK细胞NKG2D受体蛋白表达以及肿瘤组织内Rae-1、H60mRNA表达的变化

结果NK细胞杀伤活性增强NK细胞受体NKG2D表达明显增加肿瘤组织Rae-1、H60mRNA表达上升结论：双歧杆菌LTA能够增强B16荷瘤小鼠NK细胞的杀伤活性,其机制可能与上调NK细胞受体NKG2D的蛋白表达和肿瘤组织Rae-1、H60mRNA的表达有关。乳酸杆菌在DC诱导抗肿瘤免疫杀伤中的作用树突状细胞（dendriticell，DC）是目前所发现的功能最强的专职抗原提呈细胞DC细胞功能的缺陷是肿瘤免疫逃逸的主要原因。通过刺激DC的抗原提呈能力，增强机体抗肿瘤免疫功能是目前肿瘤生物免疫治疗的重点与热点乳酸杆菌+冻融宫颈癌抗原负载DC体外刺激T细胞的增殖情况以及上清液中IL-12与IFN-γ的含量；测定乳酸杆菌冻融抗原致敏DC激活的细胞毒T淋巴细胞（CTL）对宫颈癌HeLa细胞的杀伤作用。与单纯冻融抗原、单纯乳酸杆菌致敏DC比较，经乳酸杆菌作用后的冻融宫颈癌抗原负载DC在体外明显增强T细胞的增殖能力；上清液中IL-12与IFN-γ的含量增加；乳酸杆菌冻融抗原致敏DC激活的CTL对宫颈癌HeLa细胞的杀伤力明显增强，提示乳酸杆菌可以增强DC诱导的对宫颈癌细胞的肿瘤免疫杀伤作用增强免疫的有效成分是什么？乳酸杆菌的DNA含有大量非甲基化CpG二核苷酸为核心的重复序列（CpGDNA)CpGDNA作为免疫佐剂可激活T细胞、DC、NK细胞等免疫活性细胞产生大量的细胞因子，增强机体的特异性和非特异性免疫效应而发挥抗肿瘤作用乳酸杆菌的RNA也可延长荷瘤小鼠的生存时间以及减小其肿瘤体积，用其致敏的DC可以增强其杀伤成纤维细胞L929、肝癌细胞H22的作用、促进IFN-β的分泌抑制致癌物质的作用

已知的致癌因素包括物理（X线）、化学（亚硝胺、氨基偶氮染料）和生物因素（某些致癌病毒）等。微生态制剂可通过多种代谢产物并以不同的机制在清除某些致癌剂或预防致癌等环节上发挥关键作用。乳酸杆菌可以产生多糖、有机酸、细菌素、过氧化氢等多种代谢产物，其主要作用是:抑制致癌病原微生物的生长和发育；抑制与癌发生有关酶

(如7α-羟化酶、β-葡萄糖苷酸酶、硝基还原酶等)的活性;减少致癌物质在体内的活化、滞留，减少致癌物质与上皮细胞的接触；抑制黏膜上皮细胞的再生,形成不利于肿瘤生长的微生态环境等，从而降低肿瘤发生的危险性。益生菌预防结肠癌

（Marotta）微生态制剂抗肿瘤作用的临床研究临床应用中，双歧杆菌、乳酸杆菌等微生态制剂主要与其他治疗手段相结合，可增强疗效，降低副作用Budagov等发现放化疗前应用嗜酸乳杆菌可保护造血干细胞，使内源性脾脏集落形成单位提高3.4~6.7倍，并减轻由放化疗所致骨髓抑制或白细胞减少，同时不影响放化疗效果。微生态制剂强化的肠内营养在胃癌术后的早期应用60例进展期胃癌病人实验组：能全力+双歧杆菌活菌制剂,共7d;对照组单用能全力观察指标：手术前1d及手术后7d外周血内毒素、肿瘤坏死因子(TNF)水平变化及淋巴细胞计数改变,并观察粪便中分泌型IgA及菌群变化结果术后7d微生态肠内营养组内毒素及肿瘤坏死因子水平明显低于对照组(P<0.01)淋巴细胞计数较术前显著增高(P<0.05)粪便中分泌型IgA较对照组明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);微生态肠内营养组患者肠道双歧杆菌、乳杆菌的总数明显增加(P<0.05),肠道菌群接近正常比例,对照组仍存在一定程度菌群紊乱。结论：胃癌术后早期应用微生态制剂强化的肠内营养可改善肠粘