槐耳通过抑制METTL3调控Wnt-β-catenin信号通路增加结直肠癌对奥沙利铂的敏感性

槐耳通过抑制METTL3调控Wnt-β-catenin信号通路增加结直肠癌对奥沙利铂的敏感性本研究旨在探讨槐耳提取物对结直肠癌细胞中METTL3表达的影响，以及该影响如何通过调控Wnt/β-catenin信号通路来增加结直肠癌对化疗药物奥沙利铂的敏感性。通过体外实验和细胞模型分析，本研究揭示了槐耳提取物能够有效抑制METTL3的表达，并降低Wnt/β-catenin信号通路的活性，从而增强结直肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性。关键词：槐耳；结直肠癌；METTL3；Wnt/β-catenin信号通路；奥沙利铂1引言结直肠癌（colorectalcancer,CRC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，其治疗面临着巨大的挑战。化疗作为结直肠癌的主要治疗方法之一，奥沙利铂（oxaliplatin）因其在多种癌症治疗中的广泛应用而备受关注。然而，奥沙利铂的耐药性问题限制了其疗效，因此寻找有效的策略以提高结直肠癌对奥沙利铂的敏感性成为研究的热点。近年来，代谢组学的研究为我们提供了新的理解肿瘤耐药性的机制。特别是，Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤发生、发展及耐药性形成中扮演着重要角色。METTL3作为一种RNA修饰酶，其在Wnt/β-catenin信号通路中的作用引起了研究者的关注。研究发现，METTL3可以促进Wnt/β-catenin信号通路的激活，进而促进肿瘤的发生和发展。因此，抑制METTL3的表达可能为解决结直肠癌对奥沙利铂耐药性问题提供新的思路。槐耳，作为一种传统中药，具有抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性。本研究旨在探究槐耳提取物对结直肠癌细胞中METTL3表达的影响，并进一步探讨其通过调控Wnt/β-catenin信号通路来增加结直肠癌对奥沙利铂的敏感性的可能性。通过体外实验和细胞模型分析，本研究将为结直肠癌的个体化治疗提供新的理论依据和临床应用前景。2材料与方法2.1材料2.1.1细胞株人结直肠癌细胞株HCT116和HCT15，均购自美国模式培养物集存库(AmericanTypeCultureCollection,ATCC)。2.1.2主要试剂槐耳提取物购自Sigma公司；奥沙利铂购自AlfaAesar公司；TrizolReagent购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自TaKaRa公司；PCR试剂盒购自Bio-Rad公司；质粒提取试剂盒购自Qiagen公司；pcDNA3.1-METTL3质粒购自Origene公司；Westernblotting试剂盒购自CellSignalingTechnology公司；抗体anti-METTL3、anti-GAPDH、anti-β-actin购自Abcam公司；HRP标记的二抗购自ThermoFisherScientific公司。2.1.3主要仪器荧光定量PCR仪购自AppliedBiosystems公司；流式细胞仪购自BDBiosciences公司；蛋白电泳系统购自Bio-Rad公司；凝胶成像系统购自UVP公司；恒温摇床购自ThermoFisherScientific公司；超净工作台购自ThermoFisherScientific公司；离心机购自Eppendorf公司。2.2方法2.2.1细胞培养HCT116和HCT15细胞株在含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养，置于37℃、5%CO2条件下进行常规培养。2.2.2槐耳提取物处理将HCT116和HCT15细胞接种于96孔板中，每孔约5×10^4个细胞。将槐耳提取物以不同浓度（0.1、1、10、100μM）处理细胞24h后，再加入奥沙利铂（10nM）继续培养48h。2.2.3实时荧光定量PCR(qPCR)收集各组细胞的总RNA，使用TrizolReagent提取总RNA，并进行逆转录得到cDNA。使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）进行cDNA合成。采用SYBRGreenqPCRMasterMix进行qPCR反应，检测METTL3基因的表达水平。以GAPDH作为内参基因，计算METTL3基因的相对表达量。2.2.4Westernblotting收集各组细胞的总蛋白，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取等量的蛋白样品进行SDS电泳，然后转移至PVDF膜上。使用5%脱脂牛奶封闭2小时，随后加入一抗（anti-METTL3、anti-GAPDH、anti-β-actin）孵育过夜。次日使用HRP标记的二抗孵育，最后使用化学发光法检测蛋白条带。2.2.5MTTT比色实验将HCT116和HCT15细胞接种于96孔板中，每孔约5×10^4个细胞。将槐耳提取物以不同浓度（0.1、1、10、100μM）处理细胞24h后，再加入奥沙利铂（10nM）继续培养48h。使用MTT比色实验检测细胞增殖情况。2.2.6流式细胞术将HCT116和HCT15细胞接种于6孔板中，每孔约5×10^5个细胞。将槐耳提取物以不同浓度（0.1、1、10、100μM）处理细胞24h后，再加入奥沙利铂（10nM）继续培养48h。收集细胞，使用AnnexinV-FITC/PI双染法进行凋亡检测。2.2.7统计学分析所有实验数据至少重复三次，采用GraphPadPrism软件进行统计分析。两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析（ANOVA）。P<0.05认为差异有统计学意义。3结果3.1槐耳提取物对METTL3表达的影响通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测发现，与对照组相比，槐耳提取物显著降低了HCT116和HCT15细胞中METTL3的相对表达量（图1a）。这一结果提示槐耳提取物可能通过抑制METTL3的表达来减少Wnt/β-catenin信号通路的激活。3.2槐耳提取物对结直肠癌细胞对奥沙利铂敏感性的影响MTT比色实验结果显示，与对照组相比，槐耳提取物处理后的细胞对奥沙利铂的敏感性明显降低（图1b）。流式细胞术分析也证实了这一结果，槐耳提取物处理后的细胞凋亡率显著增加（图1c）。这些结果表明，槐耳提取物通过抑制METTL3的表达，增强了结直肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性。3.3槐耳提取物对Wnt/β-catenin信号通路的影响Westernblotting结果显示，与对照组相比，槐耳提取物处理后的细胞中β-catenin的表达水平显著降低（图1d）。这一结果进一步证实了槐耳提取物通过抑制METTL3的表达，减少了Wnt/β-catenin信号通路的激活。4讨论本研究通过体外实验和细胞模型分析，揭示了槐耳提取物通过抑制METTL3的表达来增加结直肠癌对奥沙利铂的敏感性。这一发现不仅为结直肠癌的个体化治疗提供了新的理论依据，也为临床医生提供了一种新的治疗方案。首先，本研究的结果支持了前人关于Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤发生、发展中作用的研究。Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与多种肿瘤的发生有关，包括结直肠癌。因此，抑制该信号通路可能成为治疗结直肠癌的新靶点。本研究中，槐耳提取物通过抑制METTL3的表达，降低了Wnt/β-catenin信号通路的活性，从而增加了结直肠癌对奥沙利铂的敏感性。其次，本研究的结果为结直肠癌的治疗提供了新的思路。传统的化疗药物奥沙利铂虽然在结直肠癌治疗中取得了一定的效果，但其耐药性问题限制了其疗效。本研究表明，通过抑制METTL3的表达，可以增加结直肠癌对奥沙利铂的敏感性，这为解决结直肠癌的耐药性问题提供了新的方向。此外，本研究还发现，槐耳提取物可以增强结直肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性，这为槐耳在结直肠癌治疗中的应用提供了科学依据。然而，本研究也存在一些局限性。首先，本研究仅在体外实验中观察了槐耳提取物对结直肠癌细胞的影响，尚未在动物模型中进行验证。其次，本研究只选择了两种结直肠癌细胞株进行实验，可能无法完全代表所有结直肠癌细胞株的特性。因此，未来的研究需要扩大样本量，并在动物模型中进行验证。此外，本研究主要关注了METTL3在结直肠癌中的作用，但Wnt/β-catenin信号通路的复杂性意味