CN114621346B 用于靶向连接蛋白半通道的组合物和方法 （德克萨斯州大学系统董事会）

201480056187.52014.08.21G.M.Yusubalieva等.AntitumorEffectsofMonoclonalAntibodieinBiologyandMedicine.提供了用于靶向连接蛋白半通道的组合物提供了采用所述单克隆抗体检测总的和细胞表21.抗体或其抗原结合部分在制备体外抑制处于病理性炎性骨关节炎或脊椎损伤风险中或诊断具有病理性炎性骨关节炎或脊椎损伤的受试者的软骨细胞中炎症反应的产品中重链可变结构域包含按照Kabat编号系统位于SEQIDNO:2的重链氨基酸序列的氨基酸位轻链可变结构域包含按照Kabat编号系统位于SEQIDNO:4的轻链氨基酸序列的氨基酸位2.如权利要求1所述的应用，其中所述受试者处于病理性炎性骨关节炎风险中或诊断3.如权利要求1所述的应用，其中所述受试者处于脊椎损伤风险中或诊断具有脊椎损4.有效量的能够结合连接蛋白43(Cx43)半通道的抗体或其抗原结合部分在制备用于三轻链CDR序列分别由SEQIDNO:8轻链氨基酸序列的氨基酸位置27-32、50-56和91-97组3[0002]本申请是要求2013年8月21日提交的美国临时专利申请序列号61/868,112的优先制作用。某些实施方案提供用来鉴定调节半通道的打开以治疗癌转移的化合物的工具和/[0008]半通道打开可通过使用比如荧光黄(Luciferyellow)、溴化乙锭、Alexa350、4异性可通过使用抑制半通道打开并因此抑制靶向试剂活性的连接蛋白特异性抗体进行验有SEQIDNO:2的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:4的氨[0012]在某些方面，第一重链区包含具有SEQIDNO:2的残基13至37的氨基酸序列区包含具有SEQIDNO:2的残基97至116的氨基酸序列的氨基酸序包含具有SEQIDNO:4的残基64至108的氨基酸序列的氨基酸序列。[0014]在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到半通道和该抗体包含具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:8的氨基酸序列的轻[0015]在某些方面，第一重链区包含具有SEQIDNO:6的残基13至37的氨基酸序列区包含具有SEQIDNO:6的残基97至116的氨基酸序列的氨基酸序包含具有SEQIDNO:8的残基66至125的氨基酸序列的氨基酸序列。含具有SEQIDNO:10的氨基酸序列的重链和具有SEQIDNO:12的氨基酸序链区包含具有SEQIDNO:10的残基94至109的氨基酸序列的氨基酸序列。[0019]在另一方面，第一轻链区包含具有SEQIDNO:12的残基9至40的氨基酸序列链区包含具有SEQIDNO:12的残基64至108的氨基酸序列的氨基酸序列。[0021]又一个实施方案提供包含如本文所述的抗体与药学上可接受的载体的药物组合5[0023]某些方面涉及使用抗体、化合物或试剂抑制软骨细胞中的炎症反应的体外方在某些方面，方法涉及通过以下方面来确定对软骨细胞中Cx43半通道打开的抑制的作用：(i)使用荧光黄或Alexa染料通过染料摄取测定法测定半通道打开，(ii)评估I道打开的抑制作用，(iii)通过流体流动剪切应力形式的机械负荷测试试剂对半通道打开[0024]某些方面涉及通过以下方面来确定抗体、化合物或试剂对抑制IL-1#和机械负荷个不同的重/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂交抗体。双特异性抗体可通过多种方法产生，包括融合杂交瘤或连接Fab'片段。参见例如Songsivilai和Lachmann,ClinExp基(当通过重组DNA技术产生时)或者化学前体或其它化学品(当化学合成时)的核酸或多6SpringHarborPress,1的技术人员而言将变得显而易见。[0038]以下附图构成本说明书的一部分，并包括在内以进一步阐明本发明的某些方通过结合这里所展示的说明书实施方案的详细描述来参考这些附图中的一个或多个可以[0040]图2示出了在不存在或存在1μg/mlCx43(E2)抗体的情况下用20μMAD处理MLO-Y4和Cx43(E2)抗体处理MLO-A5成骨细胞的[0041]图3示出了模型系统，其用于研究骨细胞Cx43半通道在调节AD对癌细胞迁移的作7[0043]图5A和5B示出了使用伤口愈合迁移测定法进行的研究的结果。来自骨细胞的CM-[0044]图6示出了另一伤口愈合迁移测定的结果。AD对MDA-MB-231细胞的迁移无直接作[0048]图10A和10B示出了得自注射到Cx43条件性敲除(cKO)小鼠的Py8119乳腺癌细胞的[0051]图13显示了通过在pH7.4下经过Cx43可渗透到间隙连接部的钙黄绿素红-橙-AM(790Da)和5μM不可渗透到间隙连接部的俄勒冈[0054]图16.显示了通过M1和M7但非M2阻断了机械[0055]图17.显示了在小鼠体内骨细胞中鼠IgG或Cx43(M1)mAb(25mg/kg)并在2小时后将伊文思蓝(Evansblue)染料注射到WT和8[0057]各种细胞能够通过由连接蛋白形成的半通道和间隙连接部与彼此以及与胞外环[0065]某些实施方案涉及使用染料摄取测定法在体外检测半通[0066]在检测半通道打开的体外测定法的一个实例中，可以使用流体流动回路设备9骼流体流动受血管外压力以及骨细胞施加的循环机械负荷驱动，并且峰值生理负荷为8至[0068]用于评估半通道功能的测定可使用足够小以穿过半通道的孔的荧光示踪剂分[0070]图2示出了得自体外染料转移测定的一个实例的结果。将MLO-Y4骨细胞在不存在对照–AD不打开成骨细胞中的Cx43半通道，并且由AD诱导的骨细胞半通道的打开被Cx43病毒启动子驱动的多瘤居中T转基因)小鼠中产生的自发性乳腺肿瘤建立了Py8119乳腺肿[0075]前列腺癌细胞系：包括雄性激素受体和5α-还原酶阳性/阴性和雄性激素敏感/非通过用胶原酶处理并用力搅拌而将骨细胞从骨碎片中释浸入含有渗透性示踪剂的记录培养基(不含HCO3的HEPES缓冲α[0085](e)测定渗透性示踪剂摄取。通过检测细胞内的示踪剂的量测定渗透性示踪剂摄初始荧光和所关注时间的荧光与基础荧光相(特异性抑制Cx43半通道的多克隆抗体)与测试试剂一起温育而进行确认。如果试剂打开[0088]在一个特定的实例中，将MLO-Y4骨细胞在不存在或存在1μg/mlCx43(E2)抗体的[0090]在某些方面，所述方法包括将原代骨细胞或骨细胞系用测试试剂在α-MEM中温育标仪(Biotek)以450nm的发射波长测量细[0092]细胞迁移测定通常在24孔组织培养板(BDBiosciences)中的transwell膜过滤器骨骼转移的试剂的体内测定法的一个实例包括确定候选试剂对骨细胞中Cx43半通道的作定。在荧光显微镜下检查骨切片，并使用ImageJ对骨中骨细胞摄取示踪剂染料的程度定[0098]骨细胞中Cx43半通道的打开可通过对胫骨施加机械负荷以打开骨细胞中的Cx43[0099]使用胫骨内注射骨转移模型和/或心内注射癌转移测定法测定测试试剂对体内对[0100]胫骨内注射骨转移模型。该方法包括将1个月大的正常或免疫低下小鼠用异氟烷还给予盐酸丁丙诺啡(0.3mg/ml)作为止痛剂。将表达荧光或化学发光标记物的癌细胞(例人想要研究在骨细胞中表达的Cx43的作用，因此产生了骨细胞特异性Cx43敲除小鼠。将floxedCx43基因纯合的小鼠与Cx43整体杂合小鼠杂交有利于骨细胞中Cx43的完全缺失。然后将Cx43fl/-小鼠(50％的子代)与表达由人类DMP-1启动子驱动的Cre重组酶的小鼠杂交。这产生了为Cx43fl/-、DMP1Cre+或Cx43fl/-、DMP1Cre-的小鼠(小百分比的为[0107]骨关节炎是一种影响着大约20％的美国成年人的普遍性疾病。该疾病导致关节炎症条件下打开并释放诸如促炎性因子的小分子。机械负荷和白介素-#1诱导软骨细胞中[0110]升高的白介素1#(IL-1#)是OA的诱导剂。不正常的关节负荷已知也会增加OA的风升高的IL-1#或创伤(不正常的负荷)导致过使用ELISA测定法来检测PGE2和ATP的释放而测的系统性鉴定已由Kabat等(1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版,UnitedStatesPublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,[0121]氨基酸置换一般是单个残基；插入通常将在约一个(1)至约二十个(20)氨基酸残少许氨基酸上进行这些改变，以便使分子的改变(特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异[0125]如本文所用的“骨架”意指抗体可变结构域的不包括定义为CDR的那些区域的区二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)实质上是带有部分铰链区的Fab的与蛋白G的结合好得多。15天后收集无胎牛血清的得自杂交瘤培养物的上清液以便产生[0130]在某些实施方案中，将小鼠单克隆抗体(M1)用于研究形成间隙连接部或/和半通单克隆抗体M1的轻链具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。[0131]在某些实施方案中，将小鼠单克隆抗体(M2)用于研究形成间隙连接部或/和半通单克隆抗体的轻链具有SEQIDNO:8所示的氨基酸序列。[0132]在某些实施方案中，将小鼠单克隆抗体(M7)用于研究形成间隙连接部或/和半通道的连接蛋白Cx43的功能，其中单克隆抗体的重链具而单克隆抗体的轻链具有SEQIDNO:12所示的氨基酸序列。[0133]免疫印迹。将MLO-Y4细胞以3x105个接种到60mm平皿中维持48h。在裂解缓冲液乙基马来酰亚胺，10μl/mlNaVO4和10μl/ml亮肽素)中收集小鼠心脏组织，匀化并以100,000xg在4℃下离心30分钟然后重悬在裂解缓冲液中。将粗制膜蛋白通过10％SDS-聚丙烯别Cx43的第二胞外环的抗Cx43E2(1:500稀释)或抗Cx43的第二胞外环的单克隆抗体(1:100稀释)印迹。通过Odyssey红外检测系统(LI-COR,Lincoln,NE,USA)检测二抗即红外体标记，再用FITC缀合的山羊抗小鼠抗体和WGA-a低浓度二价阳离子的培养基(低[X2])添加0.5mMEGTA但不添加CaCl2和MgCl2。记录培养基350(Invitrogen,Eugene,Oregon,USA)(10mM的PBS溶液)使用均得自Eppendorf(Eppendorf)的显微操纵器InjectManNI2和Femtojet进行细胞的显微注射。在供体细胞用5μM钙黄绿素红-橙-AM(790Da)和5μM俄勒冈绿488BAPTA-2-AM(1752Da)在37℃温育40分钟。间隙连接部分子间通讯可通过用可渗透间隙连接部的示踪剂染料钙黄绿素红-橙和不可渗透间隙连接通道的俄勒冈绿488BAPTA-2同时标记细胞而跟踪。通过胰蛋白酶消化从板移除预加载的供体细胞。使预加载的细胞在以1:4供体与受体比率培养的未标免疫缀合物)用材料包衣以避免化合物受到可使化合物失活的酸和其它自然条散体而言)以及通过使用表面活性剂而维持适[0145]药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液规的介质或试剂与活性化合物不相容，否则均设想了其在本发明的药物组合物中的用途。[0148]可与载体材料结合以产生单剂量形式的活性成分的量将根据进行治疗的受试者成分，优选约0.1％至约70最优选约1％至约30％的活性成分与药学上可接受的载体结明的剂量单位形式规格受控于并直接取决于(a)活性化合物的独特特性和要实现的特定治次。本发明的抗半通道抗体的优选剂量方案包括经由静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体的血浆抗体浓度并在一些方法中实现约25-3所选的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明的特定组合物的活[0154]本发明的组合物可使用本领域已知的多种方法中的一种或多种通过一种或多种施用途径进行施用。如技术人员将会认识到，施用途径和/或模式将根据所需的结果而变[0019]aatgagaagttca[0020]atgcaactcagcagcctgacatctgaggac[0021]aacccctactatactat[0050]atctcataca[0082]aatgagaagttca[0083]atgcaactcagcagcctgacatctgaggac[0084]aacccctactatactat15[0113]atgagctgca[0148]ttcaagagcaagg