2024 饲料中氯苯那敏和溴苯那敏的测定 液相色谱-串联质谱法

GB/T44740—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规

定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口。

本文件起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所。

本文件主要起草人：索德成、樊霞、管鑫、冯玉超、肖志明、王克然、鲁利萍、伍宏凯、张航俊、

唐建。

Ⅰ

GB/T44740—2024

饲料中氯苯那敏和溴苯那敏的测定

液相色谱﹘串联质谱法

1范围

本文件描述了饲料中氯苯那敏和溴苯那敏的液相色谱﹘串联质谱法测定方法。

本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂中氯苯那

敏和溴苯那敏的测定。

本文件的检出限为0.003mg/kg、定量限为0.01mg/kg。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文

件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用

于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T20195动物饲料试样的制备

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样中待测物用甲酸﹘乙腈溶液提取，经混合型强阳离子交换固相萃取小柱净化，液相色谱﹘串联质

谱仪测定，基质匹配标准曲线校准，外标法定量。

5试剂或材料

除非另有规定，仅使用分析纯试剂。

5.1水：GB/T6682，一级。

5.2甲酸：色谱纯。

5.3甲醇：色谱纯。

5.4乙腈：色谱纯。

5.50.1%甲酸溶液：移取1mL甲酸（5.2），用水稀释至1000mL，混匀。

5.61%甲酸﹘乙腈溶液：移取1mL甲酸，用乙腈稀释至100mL，混匀。

5.75%氨水﹘甲醇溶液：取氨水5mL，加甲醇稀释至100mL，混匀。

5.8氯苯那敏标准储备溶液（500μg/mL）：称取氯苯那敏（CAS号：132﹘22﹘9，纯度≥98%）

25mg，精确至0.01mg，用乙腈溶解，转移至50mL容量瓶中定容，摇匀。－18ºC以下贮存，有效期不

超过6个月，或采用标准物质/标准样品。

5.9溴苯那敏标准储备溶液（500μg/mL）：称取溴苯那敏（CAS号：86﹘22﹘6，纯度≥98%）

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25mg，精确至0.01mg，用乙腈溶解，转移至50mL容量瓶中定容，摇匀。－18℃以下贮存，有效期不

超过6个月，或采用标准物质/标准样品。

5.10混合标准中间溶液（50μg/mL）：分别准确移取氯苯那敏标准储备溶液（5.8）和溴苯那敏标准

储备溶液（5.9）1mL于10mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容，混匀。－18℃以下贮存，有效期不超

过1个月。

5.11标准系列工作溶液：准确移取适量的混合标准中间溶液（5.10），用0.1%甲酸溶液（5.5）配制

成质量浓度分别为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的标准工作溶

液，混匀。临用现配。

5.12混合型阳离子交换固相萃取小柱：以苯磺酸化的聚苯乙烯﹘二乙烯基苯高聚物为填料，

60mg/3mL，或性能相当者。

5.13微孔滤膜：0.22μm，有机系。

6仪器设备

6.1液相色谱﹘串联质谱仪：配电喷雾离子源。

6.2分析天平：精度分别为0.1mg和0.01mg。

6.3离心机：转速不低于8000r/min。

6.4超声波清洗仪。

6.5固相萃取装置。

6.6氮吹仪。

7样品

按照GB/T20195规定制备试样，至少200g配合饲料、浓缩饲料和精料补充料粉碎使其全部过

0.425mm试验筛，充分均匀；添加剂预混合饲料和混合型饲料添加剂无须粉碎，混合均匀，装入密闭容

器中，备用。选取类型相同、均匀一致，且在待测物保留时间处，其仪器响应值小于方法定量限相应值

30%的饲料样品，作为空白试样。

8试验步骤

8.1提取

平行做2份试验。称取配合饲料、浓缩饲料、精料补充料5g，添加剂预混合饲料和混合型饲料添加

剂1g，精确至0.1mg，置于50mL离心管中，加入20mL1%甲酸﹘乙腈溶液（5.6），超声提取

30min，每10min振摇1次，8000r/min离心5min，取上清液，备用。

8.2净化

混合型阳离子交换固相萃取小柱（5.12）依次用3mL甲醇、3mL水活化，准确移取10mL备用液

过柱。用3mL水和3mL甲醇淋洗混合型阳离子交换柱，抽干。用3mL5%氨水﹘甲醇溶液（5.7）洗

脱，收集洗脱液于40℃水浴氮气吹至近干，准确加入1mL0.1%甲酸溶液（5.5）复溶，涡旋混匀，过

微孔滤膜（5.13），上机。

8.3基质匹配标准系列溶液的制备

选取空白试样，按8.1和8.2步骤处理，在净化、吹干后的残渣中，分别准确添加1mL混合标准溶

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液，配制成质量浓度分别为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的基

质匹配标准系列溶液。过微孔滤膜（5.13），上机。

8.4液相色谱参考条件

8.4.1液相色谱参考条件

液相色谱参考条件如下：

a）色谱柱：C18色谱柱，柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.7μm，或性能相当者；

b）流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈，梯度洗脱，洗脱程序见表1；

c）流速：0.4mL/min；

d）柱温：30℃；

e）进样量：5µL。

表1梯度洗脱程序

时间/min流速/（mL/min）A/%B/%

00.48020

0.50.48020

20.44060

2.50.43070

3.00.4595

4.50.4595

5.50.47030

6.10.48020

7.00.48020

8.4.2质谱参考条件

质谱参考条件如下：

a）电离方式：电喷雾电离，正离子模式（ESI+）；

b）检测方式：多反应监测（MRM）；

c）毛细管电压：3.0kV；

d）离子源温度：250℃；

e）脱溶剂温度：320℃；

f）雾化气、干燥气为高纯氮气，碰撞气为高纯氩气或其他合适气体；

g）喷雾电压、碰撞能量等参数应优化至最优灵敏度；

h）监测离子对、解离电压和碰撞能量见表2。

表2氯苯那敏和溴苯那敏的定性离子对、定量离子对、解离电压和碰撞能量参考值

化合物离子对(m/z)解离电压/V碰撞能量/eV

275.2>167.244

氯苯那敏50

275.2>230.2ａ45

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表2氯苯那敏和溴苯那敏的定性离子对、定量离子对、解离电压和碰撞能量参考值（续）

化合物离子对(m/z)解离电压/V碰撞能量/eV

319.1>167.1ａ44

溴苯那敏50

319.1>27455

a

定量离子。

8.4.3基质匹配标准系列溶液和试样溶液测定

在仪器的最佳条件下，分别取基质匹配标准系列溶液（8.3）和试样溶液（8.2）上机测定。庆大霉

素标准溶液的定量离子色谱图见附录A。

8.4.4定性

在相同试验条件下，试样溶液中待测物的保留时间应与标准系列溶液（浓度相当）中待测物的保留

时间一致，其相对偏差在±2.5%之内。根据表2选择定性离子对，比较试样色谱图中待测物监测离子对

的相对离子丰度与浓度接近的标准系列溶液中对应的监测离子对的相对离子丰度，若偏差不超过表3规

定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。

表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差

相对离子丰度>50%>20%~50%>10%~20%≤10%

最大允许偏差±20%±25%±30%±50%

8.4.5定量

以基质匹配标准系列溶液中各待测物的质量浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，

标准曲线的相关系数应不低于0.99。试样溶液与标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围

内，如超出线性范围，应重新测定。单点校准定量时，试样溶液中待测组分质量浓度与标准溶液质量浓

度相差不超过30%。

9试验数据处理

试样中待测物含量以质量分数wi计，数值以毫克每千克（mg/kg）表示。多点校准按式（1）计

算，单点校准按式（2）计算。

ρi×V1×V3

wi=…………（1）

V2×m×1000

式中：

ρi─由标准曲线得到的试样溶液中待测物质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

V1─试样提取溶液总体积，单位为毫升（mL）；

V3─净化、氮气吹至近干后复溶试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；

V2─净化用试样提取溶液体积，单位为毫升（mL）；

m─试样质量，单位为克（g）；

1000─换算系数。

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Ai×ρs×V1×V3

wi=…………（2）

As×V2×m×1000

式中：

Ai─试样溶液待测物色谱峰面积；

ρs─标准溶液组分i的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

V1─试样提取溶液总体积，单位为毫升（mL）；

V3─净化、氮气吹至近干后复溶试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；

As─标准溶液待测物色谱峰面积；

V2─净化用试样提取溶液体积，单位为毫升（mL）；

m─试样质量，单位为克（g）；

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