农药室内生物测定试验准则-控藻剂对铜绿微囊藻活性测定试验方法

ICS65.100.01T/ZNXXXX—XXXX农药室内生物测定试验准则控藻剂对铜绿微囊藻活性测定试验方法Pesticideguidelinesforlaboratorybioactivitytests——AlgaecideactivityonMicrocystisaeruginosa(征求意见稿)XXXX-XX-XX发布浙江省农药工业协会  发布XXXX-XX-XX实施T/ZNXXX-XXXX范围本文件规定了控藻剂对铜绿微囊藻活性测定试验的试验方法、试验操作、数据处理、质量控制、试验报告等的基本要求数据。本文件适用于控藻剂对铜绿微囊藻活性测定的室内试验和评价。用于登记，需要农药登记主管部门认可。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T31270.14-2014化学农药环境安全评价试验准则第14部分：藻类生长抑制试验术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。试验概述本试验用供试物配制一系列不同浓度的试验药液，然后将试验药液与藻液混合后，连续72h观察实验用藻的生长抑制情况，并求出半效应浓度EC50（72h）值以及95%置信限。试验方法材料和条件供试生物铜绿微囊藻（Microcystisaeruginosa）。供试物农药制剂、原药或纯品。对难溶于水的农药，可用少量对藻毒性小的有机溶剂、乳化剂或分散剂助剂，用量不超过0.1mL(g)/L。主要仪器设备主要仪器设备如下：——血球计数板；——分光光度计；——显微镜；——光照培养箱；——高压蒸汽灭菌锅；——玻璃器皿等。培养基采用BG-11培养基培养铜绿微囊藻，培养基配方参见附录A。试验条件试验环境温度21℃~24℃，单次试验试验温度控制在±2℃；连续均匀光照，光照强度差异应保持在±15%范围内，光强4440lx~8880lx。试验操作试验用藻的预培养按无菌操作法将试验用藻接种到装有培养基的锥形瓶内，在5.1.5的条件下培养。每隔96h接种一次，反复接种2次~3次，使藻基本达到同步生长阶段，以此作为试验用藻。每次接种时在显微镜下观察，检查藻种生长情况。预试验按正式试验的条件，以较大的间距设置若干组浓度，求出供试物使实验用藻生长受抑制的最低浓度和不受抑制的最高浓度，在此范围内设置正式试验的浓度。正式试验在预试验确定的浓度范围内以一定的比例间距（几何级差应控制在3.2倍以内）设置5个~7个浓度组，并设立一个空白对照组，使用助溶剂的还应增设溶剂对照组，每个浓度设3个重复。试验观察期为72h，每隔24h取样，在显微镜下用血球计数板准确计数藻细胞数，或用分光光度剂直接测定藻的吸光率。用血球计数板时，用一样品至少计数两次，如计数结果相差大于15%，应予重复计数。依据试验物质性质选择合适的计数方法。数据处理生物量增长的抑制百分率处理组铜绿微囊藻生物量增长的抑制百分率按式（1）计算：(1)式中：Iy——处理组生物量增长量的抑制百分率，%；Yc——空白对照组测定的铜绿微囊藻生物量，用细胞数表示时单位为个每毫升（个/mL）；Yt——处理组测定的铜绿微囊藻单位生物量，用细胞数表示时单位为个每毫升（个/mL）。生长率的抑制百分率处理组铜绿微囊藻生长率的抑制百分率按式（2）计算：(2)式中：Ir——处理组生物量增长量的抑制百分率，%；µc——空白对照组测定的铜绿微囊藻生物量，用细胞数表示时单位为个每毫升（个/mL）；µt——处理组测定的铜绿微囊藻单位生物量，用细胞数表示时单位为个每毫升（个/mL）。半效应浓度采用线性刻度坐标，绘制抑制百分率对试验物质浓度的曲线，求出50%生长量抑制时的EC50值。质量控制质量控制条件包括：——供试生物应是处于对数生长期的纯种藻；——对照组和各浓度组的试验温度、光照等环境条件应按要求完全一致；——试验起始藻浓度应控制在5×106个/mL；——试验开始后72h内，对照组藻细胞浓度应至少增加16倍。试验报告试验报告应包含下列内容：——供试物的信息，包括供试农药的通用名、化学名称、结构式、CAS号、纯度基本理化性质、来源等；——供试生物名称、来源、培养基及培养方法；——试验条件，包括实验持续时间、温度、光照（光强和光周期）、实验容器（容器、型号、密闭方法）、静置、振荡或通气方式、测试液体积、pH、溶剂及其浓度、铜绿微囊藻生长的测定方法等；——供试物的浓度与抑制曲线图，得出的EC50值，并注明计算方法；——观察到的效应：细胞颜色、形态和大小变化；粘连或聚结情况；死亡、抑藻或杀藻效应情况等；——试验质量控制条件描述。培养基配方（资料性附录）表A.1BG-11培养基配方序号组分母液浓度母液用量1硝酸钠NaNO315g/100mL蒸馏水10mL2磷酸氢二钾K2HPO42g/500mL蒸馏水10mL3七水硫酸镁MgSO4·7H2O3.75g/500mL蒸馏水10mL4二水氯化钙CaCl2·2H2O1.8g/500mL蒸馏水10mL5柠檬酸C6H8O70.3g/500mL蒸馏水10mL6柠檬酸铁铵FeC6H5O7·NH4OH0.3g/500mL蒸馏水10mL7EDTA钠盐EDTANa20.05g/500mL蒸馏水10mL8碳酸钠Na2CO31g/500mL蒸馏水10mL9A5(Tracementalsolution)

1mL/L硼酸H3BO32.86g/L蒸馏水1mL四水氯化锰MnCl2·4H2O1.86g/L蒸馏水七水硫酸锌ZnSO4·7H2O0.22g/L蒸馏水二水钼酸钠Na2MoO4·2H2O0.39g/L蒸馏水五水硫酸铜CuSO4·7H2O0.08g/L蒸馏水六水硝酸钴Co(NO3)2·6H2O0.05g/L