CN114854668B 补充牛磺酸的细胞培养基和使用方法 （瑞泽恩制药公司）

201680041992.X2016.08.03本发明涉及培养表达度普利尤单抗(dupi牛磺酸可加入无血清的培养基或化学成分确定2其中与来自在含有小于0.1mML-牛磺酸的细胞培养基中增殖或维持的细胞的度普利3.根据权利要求1所述的方法，其中在(b)中6.根据权利要求1所述的方法，其进一步段包括在未补充L-牛磺酸的基础细胞培养基中增殖或维持C段包括在补充有0.1mM至10mML-牛磺酸的基础细胞培养基中增殖或维持C8.根据权利要求7所述的方法，其中所述生长阶段包括在包含0.1mM至1mML-牛磺酸、10.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤(b)期间每天用L-牛磺酸补充所313.根据权利要求1所述的方法，其中CHO其中与来自在含有小于0.1mML-牛磺酸的细胞培养基中培养的CHO细胞的度普利尤单16.根据权利要求15所述的方法，其中与在含有小于0.1mML-牛磺酸的细胞培养基中17.根据权利要求15或16所述的方法，其中与在含有小于0.1mML-牛磺酸的细胞培养18.根据权利要求15或16所述的方法，其中与在含有小于0.1mML-牛磺酸的类似细胞19.根据权利要求15或16所述的方法，其中细胞培养基包含0.1mM至1mML-牛磺酸、0.5mM至1mML-牛磺酸、1mM至5mML-牛磺酸、121.根据权利要求15或16所述的方法，包括在(c)中在包含0.22.根据权利要求15或16所述的方法，其中编码度普利尤单抗的核酸在细胞中是稳定23.根据权利要求15或16所述的方法，包括向细胞培养基中加入一种或多种使用点添EDTA和柠檬酸钠中的任何一种或多种。4(b)用0.1mM至10mML-牛磺酸补充成分确定的细胞培养基并在生产阶段期间表达度普其中与在含有小于0.1mML-牛磺酸的细胞培养基中表达度普利尤单抗的CHO细胞相27.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括在生长阶段期间用0.1mM至10mML-牛(a)在包含0.1mM至10mML-牛磺酸的无血清的细胞培养基中培养表达度普利尤单抗的CHO细胞，其中与在含有小于0.1mML-牛磺酸的细胞培养基中表达度普利尤单抗的细胞相其中所述细胞在生长阶段期间在35℃至38℃的温度培养，而在30.根据权利要求29所述的方法，其中与在含有小于0.1mML-牛磺酸的细胞培养基中33.根据权利要求32所述的方法，其中与在含有小于0.1mML-牛磺酸的细胞培养基中34.根据权利要求32所述的方法，其中与在含有小于0.1mML-牛磺酸的细胞培养基中35.根据权利要求32所述的方法，其中与在不存在L-牛磺酸的情况下在细胞培养基中培养至少6天的表达度普利尤单抗的重组细胞系相比，所述重组细胞系在补充有L-牛磺酸的细胞培养基中培养至少6天并且表达更高滴度537.根据权利要求35所述的方法，其中来自在补充有L-牛磺酸的细胞培养基中培养了至少6天的表达度普利尤单抗的细胞的度普利尤单抗的滴度比来自在不存在L-牛磺酸的情6于培养重组真核细胞用于产生蛋白生物治疗剂的添加牛为细胞培养中营养物不均衡的后果，最后抑制细胞生长(Fan,Y.等人Biotechnol达到降低包含重组产生的多肽的组合物颜色浓度的期望结果(WO2014145098A1,2014年9月18日公开)。促进未成熟的视网膜色素上皮细胞成熟化为成熟的视网膜色素上皮细胞的包的生产力同时将可能的有毒细胞代谢副产物例如氨减至最小的细胞培养方法为极其期望7酸对于培养效能或所产生的抗体质量并无负[0013]在某些实施方案中，培养基进一步包含由下列组成[0016]在某些实施方案中，整个过程(包含基础培养基和进料)含有总计至少115mM的氨8[0021]本发明提供以高产率产生感兴趣蛋白的方法，其包括于含有至少约0.1mM至约某些实施方案中，相较于缺乏牛磺酸补充物或含有低于0.1mM牛磺酸补充物或在另外相同[0023]在另外的方面，本发明提供在细胞培养基(例如任何前述方面所述的培养基的实施方案)中培养细胞的方法。在一个实施方案中，此方法使用在(1)含有至少0.1mM±选选自表1的氨基酸的混合物的氨基酸的培养基中增殖或维持细胞[0024]在一个实施方案中，此任选的氨基酸补充物混合物由表1的氨基酸组成的群中选9例如ScFv分子或捕捉阱分子(trapmolecule)。捕捉阱分子包括(但不限于)VEGF阱和IL-1[0028]如果通过于各种形式的无血清培养基中包括牛磺酸而对于比较物对照培养的滴度至少9至少10至少11至少12至少13至少14至少15至少16至少17至少18至少19至少20至少21至少22至少得到比不含有补充物(即低于0.1mM牛磺酸或无牛磺酸补充物)的类似细胞培养中降低至少[0030]在另外的实施方案中，此方法包括于细胞培养基中加入一个或多个使用点NaHCO344344434何前述方面所述的无血清细胞培养基的实施方案中或根据文中所述的方法的实施方案中17天滴度产生，其比类似细胞于含有低于0.1mM或未补充牛磺酸的无血清细胞培养基所产少12至少13至少14至少15至少16至少17至少18至少19至少20至少21至少22至少23至少24至少25至少26至少27至少28%,码感兴趣蛋白(例如抗体或其他抗原结合蛋白)[0036]图1显示每天从产生Ab3的细胞培养中的生产培养所回收的其中提供与无牛磺酸补充相比(以虚线所连接的x)的牛磺酸-补充(以实线所连接的实心正[0037]应理解本发明不限于特定的方法和所述的实验条件，因为方法和条件可能改[0042]文中所用的段落标题仅作为组织目的且不应视为限制所述的主题。除非另有指引述和讨论的各种通用和更具体参考文献中所述来进行。参见，例如Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual,3rded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001)和Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates(1992),HarlowandLaneAntibodies：ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,如经产生为生物医药物质的嵌合蛋白(如捕捉阱分子)、抗体或抗体部分(例如VH、VL、[0048]“抗体”是指通过二硫键相连接的四条多肽链(二条重(H)链和二条轻(L)链)所组个Fab片段通过二硫桥在铰链区相连接的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1区所组成；包括使用链霉亲和素核心区来产生四聚化scFv分子(Kipriyanovetal.(1995)Human标签来产生二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanovetal.(1994)Mol.Immunol.31：黏附分子可使用现有技术熟知的标准重组DNA技术来获得(参见Sambroo酸残基(例如通过随机或定点突变于体外导入突变或通过体内的体细胞突变)，例如在CDR种例如小鼠的生殖系的CDR序列已嫁接至人类框架的实施方案中，重组的人类抗体于体外进行突变(或当使用人类Ig序列的转基因动物时为体内体细胞突变)且因此该重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列，当衍生自人类生殖系VH和(包括Fc结构域)融合的融合蛋白的制备已有描述，例如Ashkenazietal.,Hollenbaughetal.,"ConstructionofImmunoglobulinFusionProteins",in(aflibercept)，其含有与VEGF受体Flk1的Ig3区融合的VEGF受体Flt1的Ig结构域2，而该VEGF受体Flk1的Ig结构域3与hIgG1的Fc结构域融合；参见美国专利第7,087,411和7,279,[0057]“细胞系”是指经由细胞的连续传代或次代培养衍生自特定品系的一种或多种细要是在进行期间并未从培养容器移除上清液，进料式批次培养可进一步与灌注培养区分，序系持续直到测定出达到最大工作容积和/恒化器中(chemostat)(参见C.Altamiranoetal.,BiotechnolProg.2001Nov-血清和低至无水产物的培养基需要另外的成分以增加细胞生长或期望的细胞培养参数，可在有或无另外的成分(例如聚胺)或增加浓度的组分如氨基酸、的培养物在各种如前面所述的培养条件下增≥30mg/L±4.5mg/L腐胺·2HCl(参见2014年9月14日公开的国际公开案第WO2014/[0076]各种其他的补充物可加到培养基中且在本领域技术人员的技术范围内以决定另含有一种或多种的D-生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟碱酰胺、吡哆醇HCl、D-泛酸有小量的水解产物可加到补充牛磺酸的培养基)(Eagle,Science,1955,112(3168)：501-504)、Ham’sF12(Ham,Proc.Nat’格尔培养基(Dulbecco,sModifiedEagleMedium)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,Wolf,Biophys.Biochem.Cytol.,1961,10：389-401)、Waymouth培养基(Davidsonand1981,78(9)：5588-5592)、VentrexHL-1培养基、白蛋白-球蛋白培养基(Orretal.,培养基(Weissetal.,1974,US4,072,565)、生物素-叶酸培养基(Cartaya,1978,US(Hasegawa,1982,US4,6976,833；Chen,US6,180,401；Chen,US5,856,179；Etcheverry,US5,705,364；MgSO42HPO4或其他磷2SeO3[0085]上述培养基的各个实施方案，以及含有[0087]细胞培养的进料策略以确保细胞在多细胞生物体或组织外最佳生长和增殖为目[0092]本发明提供于上述的补充牛磺酸的细胞培养基中包括表达感兴趣蛋白的细胞系批次培养一般已为现有技术所知并应用于优化蛋白产量(参见Y.M.Huangetal.,[0095]其中未提供培养基交换的细胞生长阶段或接种培养(即最初细胞培养)通常后续[0096]本发明提供在生产细胞培养开始时(第0天)包括约0.1mM至约10mM牛磺酸的细胞容器中，具有约50至100mL培养基的250ml容器中，具有约100至200mL培养基的500mL容器培养基可含有大部分的细胞培养基的组分，例如约和肽生长因子的非限定实例包括血管生成素、骨塑型蛋白(BMP)、脑衍生神经营养因子长因子α(TGF-α)、转形生长因子β(TGF-β)、肿瘤凋亡因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子牛磺酸的细胞培养所产生的蛋白滴度大至少4至少5至少6至少7至少8至少9至少10至少11至少12至少13至少14至少15至少16至少17至少18至少19至少20至少21至少22至少23至少24至少25%,至少26至少27至少28％或至少29％。在某些实施方案中，由补充牛磺酸培养基的细胞培养所产生的蛋白滴度比未补充牛磺酸的类似或相同细胞培养所产生的蛋白滴度大至培养基中细胞培养的氨浓度降低大于4大于5大于6大于7大于8大于9%,大于10大于15或大于20％。比未补充牛磺酸培养基中所培养的相同哺乳动物细胞的蛋白滴度大至少100mg/L，至少酸培养基所培养的类似或相同细胞的蛋白滴度(产率)大至少2至少3至少4至少5至少6至少7至少8至少9至少10至少11至少12至少13至少14至少15至少16至少17至少18至少19至少20至少21至少22%,体抗体(例如，如美国专利第9,132,192号所述的抗-EGFR抗体或如美国专利申请公开案第US2015/0259423A1号所述的抗-EGFRvIII抗体)、抗-前蛋白转化酶枯草溶菌素-9抗体(例如，如美国专利第8,062,640号或美国专利申请公开案第US2014/0044730A1号所述的抗-如，如美国专利申请公开案号US2014/0271658A1或US2014/0271642A1所述的抗-IL33抗抗-RSV抗体)、抗-分化群3(例如，如美国专利申请公开案号US2014/0088295A1和US20150266966A1以及美国申请案第62/222,605号所述的抗-CD3抗体)、抗-分化群20(例如，如美国专利申请公开案号US2014/0088295A1和US20150266966A1以及美国专利第7,述的抗-MERS抗体)、抗-伊波拉病毒抗体(例如，描述于美国专利申请公开案第US2016/性抗体(如描述于美国专利申请公开案号US2014/0088295A1和US20150266966A1)、抗-CD3x抗-黏蛋白16双特异性抗体(例如，抗-CD3x抗-Muc16双特异性抗体)和抗-CD3x抗-前列某些实施方案中，此受体Fc-融合蛋白含有两个或多个与单一配体或多配体结合的不同受一编码感兴趣蛋白的重组的异源性聚核苷酸结构。此结构可为游离基因组(episome)或其可为天然整合至细胞基因组的组件。细胞也可在不具有于异源多肽结构上所编码的蛋白而生产阶段可发生在约29℃至37℃的第二温度，任选从约30℃至36℃或从约30℃至34℃。天。生产细胞培养可如连续进料培养系统来运作，如于恒化器中(参见C.Altamiranoetal.,2001上文)或根据进料批次法(Huang,2程化以表达商业或科学上感兴趣的多肽。基因工程化细胞涉及以重组的聚合苷酸分子转胞融合)使得宿主细胞表达期望的重组多肽。用于基因工程化细胞或细胞系来表达感兴趣术。Ausubeletal.,eds.(Wiley&Sons,NewYork,1988,andquarterlyupdates)；Sambrooketal.,MolecularCloning：ALabora二氢叶酸还原酶(DHFR)-缺陷的突变细胞系(Urlaubetal.(1980),ProcNatlAcadSci性。CHO细胞和由其所重组表达的蛋白已被广泛定性且管理当局