斯里兰卡木薯花叶病毒检测技术规程编制说明

中国热带作物学会

团体标准《斯里兰卡木薯花叶病毒分子检测技术规程》（征求意见稿）编制说明《斯里兰卡木薯花叶病毒检测技术规程》起草组2026年6月一、工作简况（一）目的意义木薯(Manihotesculenta)为大戟科(Euphorbiaceae)木薯属灌木状多年生作物，起源于热带美洲地区，和甘薯、马铃薯并称为世界三大薯类作物，也是除谷类和豆类作物外最重要的粮食作物之一。由病毒引起的木薯花叶病(CassavaMosaicDisease，CMD)是世界木薯种植中的第一大病害，全球范围内每年因花叶病影响可造成2500万吨木薯产量损失，其病原体木薯双生病毒是我国重要的进境植物检疫性有害生物。2018年7月，我国发现木薯花叶病毒病，分子检测和鉴定结果发现致病病原为斯里兰卡木薯花叶病毒（SriLankancassavamosaicvirus,SLCMV）。2019-2023年华南地区木薯种质圃和苗圃均有零星发生。2024年在广西北海地区扩散蔓延，2025年发病面积超过6万亩，病害导致木薯叶面花叶、卷曲、植株矮小甚至死亡，能使木薯产量降低30%以上，淀粉含量降低40%，是目前东南亚和我国木薯种植业为害最严重的病害之一。种茎是木薯繁育的重要来源，病毒主要经由种茎和烟粉虱进行传播，罹患病毒的种茎外观与健康植株无差别，因此在种植前对木薯繁殖种茎进行病毒检测，是防治病害扩散蔓延的首要关键措施。同时，在木薯种植过程中，通过病害监测，抽样检测病毒也是有效防控病害的关键步骤。因此，对病毒的准确检测，是预防和控制病害的重要技术保障。病原的早期检测包括常规PCR、多重PCR、巢式PCR、酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）以及单管比色环介导等温扩增（LAMP）等技术，常用于病害鉴定、检测等领域。双生病毒AV1基因编码病毒外壳蛋白（CP），负责包裹病毒单链DNA基因组，承担病毒粒子组装、介体传播（烟粉虱/叶蝉传毒）、寄主侵染识别等核心功能，功能约束极强，同一病毒不同分离物的AV1序列变异极小。不同双生病毒（如TYLCV、菜豆金色花叶病毒、木薯花叶病毒）AV1基因核苷酸分化程度高，依此设计种特异性引物，不会出现交叉扩增。本标准基于SLCMV外壳蛋白AV1基因保守序列设计的引物和探针，分别从常规PCR、巢氏PCR和TaqMan荧光定量PCR建立SLCMV检测技术规范，为专业、高效、准确及可复制的标准化操作提供指导。（二）任务来源2025年6月，国家木薯产业技术体系病害防控岗团队向中国热带作物学会申报团体标准《斯里兰卡木薯花叶病毒检测技术规程》，并于2025年6月1日获得立项，项目编号2025002976。（三）起草单位标准起草单位长期从事木薯病害综合防控技术研究和示范推广工作，系统研究了木薯花叶病监测、发生流行规律及综合防控，前期已明确了斯里兰卡木薯花叶病在国内的危害现状、鉴定了病原物，明确了病害发生流行规律、建立了病害综合防控技术；发表相关研究论文20余篇，出版专著2部，授权国家发明专利3项，研究制定木薯细菌性萎蔫病和花叶病毒监测相关的行业标准1项、团体标准1项，具备本标准制定的实力和经验。（四）主要工作过程2025年6月6日收到“中国热带作物学会关于《天然生胶重卡轮胎专用胶》等9项团体标准项目立项的通知”文件，由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所负责《斯里兰卡木薯花叶病毒检测技术规程》标准的制定，成立本标准制定小组，共有王国芬、黄贵修、时涛、李超萍、陈奕鹏、劳赏业、何翠翠、卢赛清等8人组成，均为产业技术体系木薯相关领域科研人员。表1和起草人员信息及分工起草人职称单位分工王国芬副研究员中国热带农业科学院环境与植物保护研究所数据汇总、整理检测报告并主笔撰写标准文稿和附录黄贵修研究员中国热带农业科学院环境与植物保护研究所统筹标准的审核，宣传及后期指导时涛研究员中国热带农业科学院环境与植物保护研究所检测的质量监督和标准修改李超萍研究员中国热带农业科学院环境与植物保护研究所病害样品的收集及检测验证，文稿修改陈奕鹏研究员中国热带农业科学院环境与植物保护研究所病害样品的收集及检测验证，文稿修改劳赏业高级农艺师广西壮族自治区合浦县农业科学研究所信息收集整理，文稿修改何翠翠副研究员中国热带农业科学院品种资源研究所信息收集整理，文稿修改卢赛清农业技术推广研究员广西壮族自治区亚热带作物研究所信息收集整理，文稿修改起草阶段标准制定小组实行标准制定与实际生产应用相结合的模式，首先，在木薯种植期间不定期对生产基地进行实地调查，掌握斯里兰卡木薯花叶病发生流行的规律，并获取样品；其次，对全国农机推广中心植保站从各地送检的样品进行检测，并报送检测结果；第三，对中国热带农业科学院环境与植物保护研究所多年来对木薯主要病虫害防控技术研究取得的成果进行整理，同时向基层植物保护技术人员征求意见，形成编制本标准的基本素材；第四，从有关学术刊物和学术性网站收集国外重要经济作物病毒方面的研究成果和资料，并对资料进行归类、加工和整理，作为编写标准的参考素材。然后按照编写标准的规范要求，形成本标准的征求意见稿。图1标准编写小组在主产区开展田间调查和采样图2标准编写小组接到的样品并进行室内检测图3斯里兰卡木薯花叶病田间症状及编写小组对技术人员进行培训二、标准编制原则和确定标准主要内容的依据（一）编制原则本文件严格按照《GB/T1.1—2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》、《GB/T20001.1—2015标准编写规则第2部分：符号标准》、《GB/T20001.5—2017标准编写规则第5部分：规范标准》等技术要求来进行修订起草。编制说明按国家技术监督局《国家标准管理办法》第二十七条的基本要求而编写。遵循“科学性、统一性、协调性、适用性、一致性和规范性”的原则。科学性。整体分析木薯花叶病毒种群遗传特异性，比对病毒种间和种内保守特异性基因AV1序列，特异性设计并合成引物、建立检测方法，验证检测的准确性及可重复性，结合团队多年在热带作物病原检测鉴定领域的前期研究基础和实践经验，结合相关国家标准、行业标准和地方标准确定本标准条款、技术参数等，确定本标准文件主要内容与主要指标。统一性。本标准做到标准结构、文体、术语、形式的统一。协调性。本标准内容符合国家法律、法规，与现行相关标准相协调。适用性。本标准内容以保障木薯健康生产为目标，以配套协调、科学合理、易于操作、经济适用为原则，按照对木薯病虫害综合防治的思路，形成技术要求和技术规范，可操作性强，便于实施。一致性。本标准中技术指标均来自于对多年积累的实验数据分析，并结合现行有关标准的要求确定，技术指标提出后经生产实践验证：按照本标准规定的技术取样和检测技术能够有效提高木薯病毒病的检测鉴定时效，为防控工作及时开展争取宝贵时机。规范性。本标准严格按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》给出的规则进行起草，文本格式规范。（二）主要内容以及确定依据本文件的章节由范围、规范性引用文件、术语和定义、原理、主要材料、检测方法、结果判定、结果记录、样品处置以及附录组成。其中“检测方法”和“结果判定”是本标准的主要技术内容。本文件针对斯里兰卡木薯花叶病毒的遗传特异性规定了检测用特异引物及其配套的样本采集、样本DNA制备、PCR反应、PCR产物检测和结果判定等内容。关于“2规范性引用文件”的引用情况本标准引用了GB6682-2008分析实验室用水规格和试验方法中的条文5规定的“规格”内容；SN/T2964-2011植物病毒检测规范条文5规定的“取样及接收样品”内容；SN/T2122-2015进出境植物及植物产品检疫抽样条文6.6规定的“薯类的抽样和取样”内容。术语和定义的确定依据本标准术语和定义主要依据现行国家标准、行业标准、国际通用标准及相关法律法规确定，优先采用已统一规范的专业术语，与现行相关标准协调一致，无冲突矛盾，保证用词统一、含义准确、无歧义。关键技术参数的确定依据（1）系统调查明确了我国木薯花叶病的分布情况木薯花叶病由植物病毒侵染引起，病原包括乙型线状病毒科（Alphaflexiviridae）木薯普通花叶病毒（Cassavacommonmosaicvirus,CsCMV）引起的木薯普通花叶病和双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）多种病毒引起的木薯双生病毒花叶病（CassavaMosaicGeminiviruses,CMGs）。其中，国内木薯种植区域木薯普通花叶病已普遍发生，但目前对植株生长及产量影响不大；斯里兰卡木薯花叶病毒（SriLankancassavamosaicvirus，SLCMV）于2017-2018年在海南省儋州市、澄迈县和文昌市的个别木薯园中发现，命名为SLCMV-HN，并于2019年正式被报道。2018-2022年，监测发现，国内海南、贵州、福建、广西等地个别薯园零星有木薯花叶病发生（海南、贵州两地样品SLCMV-DG1922和SLCMV-GZ1924病毒全基因组序列GenBank登录序列号为MN688214-MN688217）。2023-2025年，由于采取了严格的种茎筛选和烟粉虱防控措施，病情逐渐得到控制，发病率和病情指数显著降低。2024年4月，斯里兰卡木薯花叶病毒在广西北海铁山港区营盘镇白东村薯农的连片木薯园中流行为害（种植种茎为多年自留种茎），病症非常典型，植株叶片出现严重卷曲；田间存在明显的发病中心并向周边扩散蔓延，当年监测到周边发病面积达2466.8亩。同时也发现，薯园周边连年种植西甜瓜等作物，烟粉虱虫口密度大，推测助推北海市突发流行花叶病的传播与蔓延。田间采集罹病‘南植199’植株，发现块根数量减少，重病田植株产量、淀粉含量较正常植株均减少40%以上。2024年，专家在北海市核心疫区多点采样并进行病毒基因组序列测定，获得该流行花叶病毒的基因组，显示为独立于以前已报道的新型病毒株系，命名为SLCMV-GXs（GenBank序列号PV832049-832058）。2025年，该类型木薯花叶病病情进一步扩散，广西北海市钦州区、玉林、贵港和梧州市，广东湛江廉江市均发现其危害，部分乡镇的花叶病株发病率超过70%，主栽品种‘南植199’为高感品种。我国木薯花叶病的症状及其病毒类型出现花叶病症状的木薯植株，可分为三种症状类型：第一种（图4.A）表现为叶片皱缩畸形，植株矮化，感病植株首先在叶片上出现褪绿的小斑点，随后逐渐扩大并与正常绿色形成典型花叶状，受侵染叶片背面有时可见突起，叶片普遍变小，叶片中部和基部常收缩成蕨叶状；第二种（图4.B）表现为叶片花叶变形，植株矮化，感病植株首先在嫩叶上出现典型花叶，逐渐在老叶及整株叶片上形成花叶症状；第三种（图4.C）表现为植株嫩叶退绿、花叶症状，叶片以退绿的小斑点向外蔓延，边界不清晰，大部分仅在上层叶片表现症状，不影响植株生长。分别将三种类型的木薯叶片进行取样检测，发现对应的病毒类型为斯里兰卡木薯花叶病毒株系单独侵染、木薯普通花叶病毒单独侵染和两种复合侵染（图5.A和B）。2018-2019年检测了384份样品发现，斯里兰卡木薯花叶病毒株系单独侵染（SLCMV）的检出率为21.1%，分别来自海南、广东、云南、广西、贵州和福建6个省区的样品；木薯普通花叶病毒单独侵染（CsCMV）的检出率为78.8%，包括所有8个省区的样品；SLCMV-CsCMV复合侵染率为33.0%，主要来自海南、广西、广东和贵州4个省区的样品（表2）。A：叶片变形或收缩，植株矮化B：叶片花叶，植株矮化C：叶片退绿斑驳图4田间木薯感染花叶病毒的3种症状AABBA：SLCMV特异性引物AF/ARPCR电泳图，目标条带大小约670bp；B：CsCMV特异性引物CsCMV-3269-F/CsCMV-3896-RPCR电泳图，目标条带大小约620bp。M：DL2000marker；1：症状类型一，SLCMV单独侵染的样品；2：症状类型二，SLCMV-CsCMV复合侵染的样品；3：症状类型三，CsCMV单独侵染的样品；4：为2种病毒的阳性克隆载体；5：阴性对照。图53种侵染类型木薯花叶病毒的特异性检测表2木薯花叶病毒3种侵染方式检测统计侵染类型检测样品数阳性样品数比例（%）SLCMV3848121.1CsCMV17914178.8SLCMV+CsCMV1795933.0我国木薯花叶病毒的鉴定经测序获得我国SLCMV-DG1922和SLCMV-GZ1924两个分离物的DNA-A和DNA-B全基因组序列，Genbank的登录号为MN688214-MN688217。BLAST比对表明，DG1922和GZ1924的DNA-A序列与已经报道的斯里兰卡木薯病毒株系柬埔寨分离物SLCMV-Cambodia（KT861468）、越南分离物SLCMV-VTN6（LC312131）、泰国分离物SLCMV-Surin1（MN544647）和中国分离物SLCMV-HN7（MH891840）的序列同源性都在99%以上。为进一步明确国内木薯花叶病毒的归类，从Genbank下载11个木薯花叶病毒株系的共37个不同分离物DNA-A序列，与DG1922和GZ1924的DNA-A序列进行聚类分析，以番茄斑驳病毒序列（L14460）为树根，应用MEGA7.0-ClastalW聚类，构建NJ（Neighbor-Joining）树。结果如图6所示，37个分离物均可严格的聚到各自所属的不同株系分枝中，DG1922和GZ1924序列与斯里兰卡木薯花叶病毒株系聚在同一分枝，证明引起国内木薯花叶病毒病的双生病毒主要为斯里兰卡木薯花叶病毒株系。图6木薯双生病毒各株系聚类图（黑框内为国内SLCMV分离物）三、主要试验或验证的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果（一）主要试验或验证的分析报告1.检测样品采集感病地块：实地监测木薯叶片是否黄化、花叶、皱缩、退绿褪绿，大小是否有变化，植株是否矮化等。抽样检测：根据木薯繁殖种茎的采收特点，选择健壮成熟种茎；数量需求每个品种至少1个样品，同一品种种植面积10亩以10亩以上，送3份样品，10亩以下送1份样。样品DNA制备称取样品0.1g和两个钢珠，一起放入2.0mL离心管，液氮中急冻后，用高通量样品研磨仪20HZ，研磨60S，直至粉末状。样品解冻前，倒掉钢珠，放入600微升提前预热65℃的CTAB提取缓冲液，剧烈震荡至充分混匀。65℃继续温浴30-60min（期间每隔10min，颠倒混匀两次），12000g离心15min，取上清。加入氯仿600μL，翻转混匀3min，12000g离心10min，取上清；重复加入氯仿600μL，翻转混匀3min，12000g离心10min，取上清；加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后，4℃静置30min，12000g离心2min，弃上清；加入1mL70%的乙醇洗涤沉淀2次，12000g离心2min，弃上清；DNA沉淀干燥后，用40μL～80μLddH2O溶解，经1%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop2000分光光度计检测浓度检测后分装，-20℃保存备用。样品PCR反应针对斯里兰卡木薯花叶病毒外壳蛋白CP基因(AV1)的特异性确定了检测引物及其检测方法。PCR反应体系可以用PCR预混试剂或者耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液、氯化镁、dNTPs等按照说明书配制。25μLPCR反应体系中DNA模板、上游引物F（10μmol/L）、下游引物R（10μmol/L）添加量均为1μL，混匀后放入PCR仪。扩增引物SL-F/R对SLCMV的扩增反应条件为：95℃预热4min；进行35次扩增循环（94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min）；72℃延伸5min。取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4℃条件下保存备用。引物CP-F/R对SLCMV的扩增反应条件为：94℃预热4min；进行35次扩增循环（94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s）；72℃延伸5min。取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4℃条件下保存备用。实时荧光PCR检测方法:使用引物SLCMV-QF638/SLCMV-QR699和探针Probe-661，以2份阳性样品DNA为模板，2份健康木薯样品DNA阴性对照，ddH2O为空白对照进行TaqManqPCR。参照试剂盒说明书进行TaqManqPCR扩增，反应程序为：95℃预变性15min；95℃变性3s，60℃退火/延伸30s，40个循环。表3SLCMV引物与探针序列引物名称序列（5'–3'）扩增产物长度用途SL12CACGGTTTCCGGTGTATGCT1058ntSLCMVnestedPCRdetectionSL13CCTGGCGTTTCTTGAGGGTATCP1FCTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTT287ntCP1RCCTTCCCGCAGAAGAAATTTTGTTCSLCMV-QF638AGCAAGAGGCTGGCAAGTATGA62ntTaqManqPCRdetectionSLCMV-QR699ACACGCCATGTACAGCATCAAProbe-661AATCATACCGAGAATGC17nt检测结果针对PCR目标产物大小确定PCR检测方法。选择DL2000DNAMarker、DNAMarkerⅢ等包含1000bp和300bp条带的DNA分子量标准。用1%琼脂糖凝胶电泳分离（电压为8V/cm）。DNA分子量标准和PCR产物的添加量均为10μL/孔。当溴酚蓝条带迁移至凝胶2/3位置时结束电泳，于凝胶成像仪紫外灯下检测PCR产物条带。实时荧光PCR检测的阴性样品和空白对照未产生扩增产物，呈现为一条直线，而2份阳性样品的扩增产物浓度均出现指数增长，表现为“S”形扩增曲线。试验结果表明所设计的引物/探针组合能有效检测到SLCMV。结果判定针对PCR和巢氏PCR检测方法：根据产物电泳检测结果中是否有1.0kb和0.3kb大小的目的条带，判断样品中是否携带斯里兰卡木薯花叶病毒。在阳性对照有目的条带且阴性对照没有目的条带的前提下，待检样品有目的条带为阳性结果，代表携带斯里兰卡木薯花叶病毒；待检样品没有目的条带为阴性结果，代表不携带斯里兰卡木薯花叶病毒。不符合前提条件则检测结果无效。针对实时荧光PCR检测方法：根据Ct值大小来判断，在阳性对照Ct值<35，且出