CN115362259B 共聚聚羟基烷酸酯混合物的制造方法、以及转化微生物 （株式会社钟化）

2022.10.09PCT/JP2021/0149582021.04.08WO2021/206155JA2021.10.14WO2017056442A1,2017.04.06WO2015146195A1,2015.1本发明提供制造共聚聚羟基烷酸酯混合物基丁酸结构单元及3一羟基己酸结构单元的共聚均组成比率为0摩尔％以上且15摩尔％以下。上述共聚聚羟基烷酸酯混合物中3一羟基己酸的平2对生产所述共聚聚羟基烷酸酯混合物的微生物进行培养所述共聚聚羟基烷酸酯混合物含有聚羟基烷酸酯级分(I基己酸的平均组成比率为0摩尔％以上且15所述共聚聚羟基烷酸酯混合物中的所述聚羟基烷酸酯级分(I)的重量比例为10~所述β酮硫解酶的氨基酸序列如序列号9或序所述包含油脂或脂肪酸的碳源为包含碳原子数6～12的中链脂肪酸或该中链脂肪酸的所述共聚聚羟基烷酸酯混合物含有聚羟基烷酸酯级分(I3基己酸的平均组成比率为0摩尔％以上且154试了以PHA作为环保型原材料或生物相容型原材料进行工业生产并用于多种(3HB_co_3HV)”)及其制造方法(例如，参照专利文献1及专利3及专利文献4)。在这些报告中，P(3HB_co_3HH)是使用由土壤分离的豚鼠气单胞菌[0006]另外，也进行了以杀虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)作为宿主并利用来源于豚菌的PHA合成酶的杀虫贪铜菌导入R体特异性烯酰CoA水合酶基因，或者通过增加宿主染色体上的R体特异性烯酰CoA水合酶基因的表达量，以植物油脂作为原料而生产P(3HB_co_码β_酮硫解酶的基因的表达而将P(3HB_co_3HH)的3HH组成比率提高至20mol％以上的例子[0008]也进行了与P(3HB_co_3HH)的物性相关的研究(参照非专利种3HH组成比率的P(3HB_co_3HH)。P(3HB_co_3HH)的结晶性随着3HH组成比率的增加而降5提高，但具有加工特性降低的倾向。例如，虽然将3HH组成比率提高至10摩尔％左右的P通过在同一细胞内一起生产上述较软质的P(3HB_co_3HH)和3HH组成比率低且熔点高(即结组成比率的PHA成分)的熔点超过100℃,因此可以推测，该PHA混合品不包含20摩尔[0025]如上所述，使用P(3HB_co_3HH)得到满足良好的加工性和机械特性这两者的成型6烷酸酯混合物中3羟基己酸的平均组成比率为22摩[0030]优选上述共聚聚羟基烷酸酯混合物中的上述聚羟基烷酸酯级分(I)的重量比例为[0031]优选上述共聚聚羟基烷酸酯混合物中3一羟基己酸的平均组成比率为10～22摩[0033]优选上述对3羟基己酰基CoA的聚合活性彼此不同的2种聚羟基烷酸酯合成酶的[0035]优选上述基因(A)为来源于气单胞菌属微生物的聚羟基烷酸酯合成酶基因或其突氨基酸序列具有99.5～100％的序列同一性的氨基酸序列。[0036]优选上述基因(B)是将来源于气单胞菌属微生物的聚羟基烷酸酯合成酶基因的一述基因(B)是编码相对于序列号6所示的氨基酸序列具有90～100％的序列同一性的氨基酸[0037]优选上述基因(B)为来源于色杆菌属微生物的聚羟基烷酸酯合成酶基因或其突变[0038]优选上述基因(B)为来源于芽孢杆菌属微生物的聚羟基烷酸酯合成酶基因或其突变体。更优选上述基因(B)是编码相对于序列号7及序列号8所示的氨基酸序列具有90~到抑制，所述β酮硫解酶对作为碳原子数6的β酮酰基CoA的β酮己酰基CoA具有硫解活[0040]优选上述β酮硫解酶具有相对于序列号9或序列号10所示的氨基酸序列显示出907~100％的序列同一性的氨基酸序列。肪酸的碳源为包含碳原子数6～12的中链脂肪酸或该中链脂肪酸的甘油酯的碳源。进一步物具有编码对3羟基己酰基CoA的聚合活性彼此不同的2种聚羟基烷酸酯合成酶的基因，20摩尔％以上，所述聚羟基烷酸酯级分(II)包含具有3一羟基丁酸结构单元的聚羟基烷酸酯混合物的3羟基己酸的平均组成比率为22摩尔％分(II)包含具有3HB结构单元的PHA、且3HH的平均组成比率为0摩尔％以上且15摩尔％以下。上述共聚PHA混合物可以通过后述的MIBK分级法而分级为上述PHA级分(I)和PHA级分[0051]上述PHA级分(I)是包含至少具有3HB结构单元及3HH结构单元的共聚PHA的级分，可以包含含有除3HB结构单元及3HH结构单元以外的羟基烷酸结构单元的PHA，优选为包含不含有除3HB结构单元及3HH结构单元以外的羟基烷酸结构单元而仅具有3HB结构单元及8[0054]上述PHA级分(II)是包含具有3HB结构单元的PHA的级分。PHA级分(II)中包含的PHA可以是仅具有3HB结构单元的均聚物，也可以是具有3HB结构单元和除此以外的羟基烷[0056]上述共聚PHA混合物中上述PHA级分(I)所占的重量比例优选为1090％、更优[0057]上述共聚PHA混合物整体显示的3HH的平均组成比率为22摩尔％以下。该3HH的平[0060]上述共聚PHA混合物可以通过利用了在甲基异丁基酮(MIBK)中的溶解度之差的溶剂分级法而分级为3HH的平均组成比率高的PHA级分(I)和3HH的平均组成比率低的PHA级分9[0063]对于上述共聚PHA混合物而言，对其进行测定而得到的差示扫描量热分析中的最[0064]上述共聚PHA混合物所显示出的最高的熔融峰温度通过以下方式测定，使用差示[0067]制造上述共聚PHA混合物时使用的微生物(以下也称为“共聚PHA混合物生产微生用基因工程方法导入外来的PHA合成酶基因而赋予了PH菌(Cupriavidus)属、沃斯特氏菌(Wautersia)属、气单胞菌属(Aeromonas)属、埃希氏菌[0069]上述共聚PHA混合物生产微生物优选为能够效率良好地分别生产3HH的平均组成[0071]作为上述对3羟基己酰基CoA的聚合活性彼此不同的2种PHA合成酶的组合的具所示的氨基酸序列(来源于气单胞菌属细菌的PHA合成酶突变体的氨基酸序列)具有90~基因的一部分和来源于贪铜菌属微生物的聚羟基烷酸酯合成酶基因的一部分组合而成的8中记载的氨基酸序列具有90～100％的序列同一性的氨基酸序列的基因。对于上述基因[0074]为了效率良好地生产3HH的平均组成比率高的共聚PHA混合物，上述共聚PHA混合[0075]作为以油脂或脂肪酸在β氧化中的碳原子数为6的中间代谢物的分解受到抑制的或插入的方法等。基因破坏操作例如包括使用包含破坏用基因或破坏用DNA的载体的同源al.,Science,343:80一84,2014)等公知的技术。例如，在CRISPR/Cas9系统中，向导RNA[0077]为了效率良好地生产3HH的平均组成比率高的共聚PHA混合物，上述共聚PHA混合Multifunctionalenzymetype2(MFE2)基因、编码具有序列号15中记载的氨基酸序列的酶的来源于黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)的MFE2基因、或者编码相对于序列号11例如，可以如国际公开第2015/115619号中记载的那样进行用于增强该基因的表达的表达[0081]在共聚PHA混合物生产微生物导入了外源性的基因的情况下，导入基因可以存在使微生物所具有的DNA的任意部位缺失的方法是本领域技术人员公知的，可以在制造本实用同源重组的机构引起的部位特异性的导入和基于第二阶段的同源重组的脱落作为原理(Bacillussubtilis)的sacB基因共存并通过第二阶段的同源重组而使基因脱落的微生物株容易地分离为蔗糖添加培养基耐性株的方法(Schweizer,Mol.Microbiol.,vol.6,[0083]需要说明的是，对于基因克隆、基MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress[0084]用于使导入基因表达的启动子没有特别限定。可以使用杀虫贪铜菌的phaC1基因列的lacN17启动子、人工制备的具有序列号17所示的来源于大肠杆菌的修饰碱基序列的棕榈仁油(也包括作为将它们分离而得到的低熔点分级的棕榈油精、棕榈双油精(palm[0090]在将上述共聚PHA混合物生产微生物的培养进行适当的时间而使上述共聚PHA混限定。需要说明的是，全部的基因操作例如可以通过MolecularCloning(ColdSpring[0095]通过使用了合成寡聚DNA的PCR，得到了具有杀虫贪铜菌H16株的phaC1结构基因(PHA合成酶基因)的上游及下游的碱基序列的DNA片段(序列号18)。用限制酶SwaI消化该DNA片段，用DNA连接酶(LigationHigh(东洋纺株式会社制))将得到的DNA片段与同样经基因破坏用质粒载体pNS2X_sacB+pha[0096]接着，使用PHA合成酶基因破坏用质粒载体pNS2X_sacB+phaC1UD如下所述进行了[0097]用PHA合成酶基因破坏用质粒载体pNS2X_sacB+phaC1UD对大肠杆菌S17_1株于豚鼠气单胞菌的PHA合成酶基因的修饰体(编码具有序列号2中记载的氨基酸序列的PHA以依据PCT国际公开第2019/142845号中记载[0099]将得到的培养液播种于包含250mg/L的卡那霉素的西蒙斯琼脂培养基(柠檬酸钠贪铜菌H16株的bktB结构基因(β_酮硫解酶基因)的上游及下游的碱基序列、作为大肠杆菌的lac启动子修饰体的lacN19启动子、以及编码具有序列号2中记载的氨基酸序列的PHA合纺株式会社制))将得到的DNA片段与同样经SwaI消化的日本特开2007_259708号公报中记载的载体pNS2X_sacB连接，制备了PHA合成酶基因导入用质粒载体pNS2X_sacB+bktbU_[0102]接着，使用PHA合成酶基因导入用质粒载体pNS2X_sacB+bktbU_lacN19_NSDG_[0103]通过使用了与上述相同的接合传递的方法将PHA合成酶基因导入用质粒载体在染色体上的原本bktB基因存在的位置导入有lacN19启动子及编码具有序列号2中记载的氨基酸序列的PHA合成酶的基因的1株菌株。将得到的菌株命名为KNK005dZ/dNSDG/trc_J4b/dbktB::lacN19_NSDG/dA20)具有杀虫贪铜菌H16株的A1528结构基因(β_酮硫解酶基因)的上游及下游的碱基序列、序列的PHA合成酶的基因的碱基序列。用限制酶SwaI消化该DNA片段，用DNA连接酶(LigationHigh(东洋纺株式会社制))将得到的DNA片段与同样经SwaI消化的日本特开pNS2X_sacB+A1528U_lacN17_AcNSRe12_A1[0106]接着，通过使用了与上述相同的接合传递的方法将PHA合成酶基因导入用质粒载体pNS2X_sacB+A1528U_lacN17_AcNSRe12_A1528D导入KNK005dZ/dNSDG/trc_J4b/dbktB::Agar培养基的筛选，分离了在染色体上的原本A1528基因存在的位置导入有lacN17启动子及编码具有序列号6中记载的氨基酸序列的PHA合成酶的基因的1株菌株。将得到的菌株命[0107]需要说明的是，共聚PHA混合物生产微生物株(1)是使杀虫贪铜菌H16株的染色体列的来源于气单胞菌属的PHA合成酶突变体的基因和编码具有序列号6中记载的氨基酸序分和来源于贪铜菌属微生物的聚羟基烷酸酯合成酶基因的一部分组合而成的编码PHA合成肠杆菌的lac启动子、以及编码具有序列号2中记载的氨基酸序列的PHA合成酶的基因的碱将得到的DNA片段与同样经SwaI消化的日本特开2007_259708号公报中记载的载体pNS2X_[0111]接着，使用PHA合成酶基因导入用质粒载体pNS2X_sacB+bktbU_lac_[0112]通过使用了与上述相同的接合传递的方法将PHA合成酶基因导入用质粒载体pNS2X_sacB+bktbU_lac_NSDG_bktb导入KNK005dZ/dNSDG/trc_J4b/dbktB/dA1528株。进一染色体上的原本bktB基因存在的位置导入有lac启动子及编码具有序列号2中记载的氨基酸序列的PHA合成酶的基因的1株菌株。将得到的菌株命名为KNK005dZ/dNSDG/trc_J4b/dbktB::lac_NSDG/dA1[0113]接着，通过使用了与上述相同的接合传递的方法将PHA合成酶基因导入用质粒载体pNS2X_sacB+A1528U_lacN17_AcNSRe12_A1528D导入KNK005dZ/dNSDG/trc_J4b/dbktB::lac_NSDG/dA1528株。进一步，通过与上述相同的培养及基于包含15％蔗糖的NutrientAgar培养基的筛选，分离了在染色体上的原本A1528基因存在的位置导入有lacN17启动子及编码具有序列号6中记载的氨基酸序列的PHA合成酶的基因的1株菌株。将得到的菌株命名为KNK005dZ/dNSDG/trc_J4b/dbktB::lac_NSDG/dA1528::lacN[0114]需要说明的是，共聚PHA混合物生产微生物株(2)是使杀虫贪铜菌H16株的染色体列的来源于气单胞菌属的PHA合成酶突变体的基因和编码具有序列号6中记载的氨基酸序分和来源于贪铜菌属微生物的聚羟基烷酸酯合成酶基因的一部分组合而成的编码PHA合成片段(序列号22)。用限制酶EcoRI及MunI消化该DNA片段，将用MunI切断国际公开2007/049716号中记载的质粒载体pCUP2而得到的产物与得到的DNA片段连接，筛选出以pCUP2的限制酶SpeI识别序列位于lacN17启动子的下游的朝向连接的产物，得到了pCUP2_lacN17。有编码具有序列号6中记载的氨基酸序列的PHA合成酶的基因及编码具有序列号2中记载的达用质粒pCUP2_lacN17_AcNSRe1[0118]如下所述，通过电穿孔法进行了质粒载体向细胞的导入。基因导入装置使用℃下将样品池内的菌液进行3小时振荡培养，用选择板(NutrientAgar培养基(DIFCO公司[0119]需要说明的是，共聚PHA混合物生产微生物株(3)是使杀虫贪铜菌H16株的染色体列的来源于气单胞菌属的PHA合成酶突变体的基因和编码具有序列号6中记载的氨基酸序分和来源于贪铜菌属微生物的聚羟基烷酸酯合成酶基因的一部分组合而成的编码PHA合成具有序列号2中记载的氨基酸序列的PHA合成酶的基因的碱基序列。用限制酶SwaI消化该DNA片段，用DNA连接酶(LigationHigh(东洋纺株式会社制))将得到的DNA片段与同样经基因导入用质粒载体pNS2X_sacB+bktbU_lac_AcNSRe12_NSDG_b[0123]接着，使用PHA合成酶基因导入用质粒载体pNS2X_sacB+bktbU_lac_AcNSRe12_[0124]通过使用了与上述相同的接合传递的方法将PHA合成酶基因导入用质粒载体pNS2X_sacB+bktbU_lac_AcNSRe12_NSDG_bktbD导入KNK005dZ/dNSDG/trc_J4b/dbktB/中记载的氨基酸序列的PHA合成酶的基因、以及编码具有序列号2中记载的氨基酸序列的[0125]需要说明的是，共聚PHA混合物生产微生物株(4)是使杀虫贪铜菌H16株的染色体列的来源于气单胞菌属的PHA合成酶突变体的基因和编码具有序列号6中记载的氨基酸序分和来源于贪铜菌属微生物的聚羟基烷酸酯合成酶基因的一部分组合而成的编码PHA合成列号7中记载的氨基酸序列的PHA合成酶的基因、编码具有序列号8中记载的氨基酸序列的PHA合成酶的基因、以及具有编码序列号3中记载的氨基酸序列的PHA合成酶的基因的碱基lacN17而得到的产物连接，得到了PHA合成酶基因表达用质粒pCUP2_lacN17_RCYB4_[0128]接着，通过微生物株制备例3中记载的电穿孔法将PHA合成酶基因表达用质粒pCUP2_lacN17_RCYB4_NSDGST导入KNK005dZ/dNSDG/trc_J4b/dbktB/dA1528株，得到了[0129]需要说明的是，共聚PHA混合物生产微生物株(5)是使杀虫贪铜菌H16株的染色体列的来源于气单胞菌属的PHA合成酶突变体的基因、以及编码具有序列号7及序列号8中记H16株的A1528结构基因(β_酮硫解酶基因)的上游及下游的碱基序列、作为大肠杆菌的lac会社制))将得到的DNA片段与同样经SwaI消化的日本特开2007_259708号公报中记载的载体pNS2X_sacB连接，制备了PHA合成酶基因导入用质粒载体pNS2X_sacB+A1528U_lacN17_[0132]接着，通过使用了与上述相同的接合传递的方法将PHA合成酶基因导入用质粒载体pNS2X_sacB+A1528U_lacN17_CsAG_A1528D导入KNK005dZ/dNSDG/trc_J4b/dbktB::lac_养基的筛选，分离了在染色体上的原本A1528基因存在的位置导入有lacN17启动子及编码具有序列号5中记载的氨基酸序列的PHA合成酶的基因的1株菌株。将得到的菌株命名为KNK005dZ/dNSDG/trc_J4b/dbktB::lac_NSDG/dA1528::lacN17[0133]需要说明的是，共聚PHA混合物生产微生物株(6)是使杀虫贪铜菌H16株的染色体列的来源于气单胞菌属的PHA合成酶突变体的基因和编码具有序列号5中记载的氨基酸序H16株的染色体上导入来源于气单胞菌属的PHA合成酶基因(编码具有序列号2中记载的氨会社制))将得到的DNA片段与同样经SwaI消化的日本特开2007_259708号公报中记载的载体pNS2X_sacB连接，制备了PHA合成酶基因导入用质粒载体pNS2X_sacB+phaZ6U_lacN17_NSDG_phaZ6D。[0139]接着，通过使用了与上述相同的接合传递的方法将PHA合成酶基因导入用质粒载体pNS2X_sacB+phaZ6U_lacN17_NSDG_phaZ6D导入KNK005dZ/trc_J[0140]需要说明的是，KNK005dZ/trc_J4b/dbktB株是使杀虫贪铜菌H16株的染色体上的气单胞菌的PHA合成酶基因的修饰体(编码具有序列号2中记载的氨基酸序列的PHA合成酶[0141]进一步，通过与上述相同的培养及基于包含15％蔗糖的NutrientAgar培养基的筛选，分离了在染色体上的原本phaZ6基因存在的位置导入有lacN17启动子及编码具有序[0143]首先，通过使用了与上述相同的接合传递的方法将PHA合成酶基因破坏用质粒载体pNS2X_sacB+phaC1UD导入KNK005dZ/trc_J[0144]进一步，通过与上述相同的培养及基于包含15％蔗糖的NutrientAgar培养基的筛选，分离了染色体上的PHA合成酶基因缺失的1株菌株。将得到的菌株命名为KNK005dZ/29)具有杀虫贪铜菌H16株的phaC1结构基因的上游及下游的碱基序列和编码具有序列号3连接酶(LigationHigh(东洋纺株式会社制))将得到的DNA片段与同样经SwaI消化的日本载体pNS2X_sacB+phaC1U_NSDGST_pha[0147]接着，通过使用了与上述相同的接合传递的方法将PHA合成酶基因导入用质粒载体pNS2X_sacB+phaC1U_NSDGST_phaC1D导入KNK005dZ/dNSDG/trc_J[0148]进一步，通过与上述相同的培养及基于包含15％蔗糖的NutrientAgar培养基的trp启动子的DNA片段(序列号31)。用限制酶MunI消化该DNA片段，将得到的DNA片段与用MunI切断pCUP2_NSDGST而得到的产物以编码PHA合成酶的基因位于trp启动子的下游的朝[0150]接着，通过微生物株制备例3中记载的电穿孔法将PHA合成酶基因表达用质粒pCUP2_trp_NSDGST导入KNK005dZ/NSDGST/trc_J4b/dbktB株，得到了pCUP2_trp_NSDGST/[0151]需要说明的是，P(3HB_co_3HH)生产微生物株(3)是使杀虫贪铜菌H16株的染色体[0153]首先，通过使用了与上述相同的接合传递的方法将PHA合成酶基因导入用质粒载体pNS2X_sacB+phaC1U_NSDGST_phaC1D导入KNK005dZ/dNSDG/trc_J4b/dbkt[0154]进一步，通过与上述相同的培养及基于包含15％蔗糖的NutrientAgar培养基的[0155]接着，通过微生物株制备例3中记载的电穿孔法将PHA合成酶基因表达用质粒pCUP2_trp_NSDGST导入KNK005dZ/NSDGST/trc_J4b/dbktB/dA1528株，得到了pCUP2_trp_NSDGST/KNK005dZ/NSDGST/trc_J4b/dbktB/dA1528株(以下[0156]需要说明的是，P(3HB_co_3HH)生产微生物株(4)是使杀虫贪铜菌H16株的染色体22NiCl2[0162]PHA生产培养基的组成设为0.385w/v％Na2HPO4·12H2O、0.067w/v％KH2PO4、2NiCl2[0164]如下所述测定了PHA蓄积量相对于干燥菌体的比例。通过离心分离从培养液中回相对于PHA级分(I)和PHA级分(II)的合计重量的重量毛细管气相色谱仪使用了岛津制作所GC_17A、毛细管色谱柱使用了GLSciences公司制℃,进一步以30℃/分的速度升温至200～290℃。根据通过上述条件[0170]使用差示扫描量热测定装置(PerkinElmer公司制DSC8500)，称量共聚PHA混合物约2mg，求出在以10℃/分的升温速度从_30℃升温至200℃时得到的DSC曲线中检测到的熔[0175]将经过单面脱模处理的PET膜(厚度50μm)的脱模面以与SUS板相反的朝向设置在物颗粒的方式覆盖与上述SUS板相同的板，设置在加热至160℃的压力机(株式会社神藤金[0176]将通过具有依据JISP_8116规定的标准埃尔门多夫撕裂试验机的功能和结构的[0179]接着，将前培养液以5.0v/v％接种于加入了2.5L的PHA生产培养基的5L发酵罐源。作为碳源，使用了棕榈油精油。培养进行至PHA蓄积量相对于干燥菌体量的比例达到[0181]在与实施例1相同的条件下进行了使用共聚PHA混合物生产微生物株(2)的培养研[0183]在与实施例1相同的条件下进行了使用共聚PHA混合物生产微生物株(3)的培养研[0185]在与实施例1相同的条件下进行了使用共聚PHA混合物生产微生物株(4)的培养研[0187]在与实施例1相同的条件下进行了使用共聚PHA混合物生产微生物株(5)的培养研[0189]在与实施例1相同的条件下进行了使用共聚PHA混合物生产微生物株(6)的培养研[0191]在与实施例1相同的条件下进行了使用P(3HB_co_3HH)生产微生物株(1)的培养研co_3HH)生产微生物株(1)蓄积得到的PHA来代替共聚PHA混合物。P(3HB_co_3HH)生产微生物株(1)蓄积得到的PHA为P(3HB_co_3HH)。MIBK可溶性级分及MIBK不溶性级分是指分别通过与PHA级分(I)或PHA级分(II)相同的方法得到的[0193]在与实施例1相同的条件下进行了使用P(3HB_co_3HH)生产微生物株(2)的培养研co_3HH)生产微生物株(2)蓄积得到的PHA来代替共聚PHA混合物。P(3HB_co_3HH)生产微生物株(2)蓄积得到的PHA为P(3HB_co_3HH)。MIBK可溶性级分及MIBK不溶性级分是指分别通过与PHA级分(I)或PHA级分(II)相同的方法得到的[0195]在与实施例1相同的条件下进行了使用P(3HB_co_3HH)生产微生物株(3)的培养研co_3HH)生产微生物株(3)蓄积得到的PHA来代替共聚PHA混合物。P(3HB_co_3HH)生产微生物株(3)蓄积得到的PHA为P(3HB_co_3HH)。MIBK可溶性级分及MIBK不溶性级分是指分别通过与PHA级分(I)或PHA级分(II)相同的方法得到的[0197]在与实施例1相同的条件下进行了使用P(3HB_co_3HH)生产微生物株(4)的培养研co_3HH)生产微生物株(4)蓄积得到的PHA来代替共聚PHA混合物。P(3HB_co_3HH)生产微生物株(4)蓄积得到的PHA为P(3HB_co_3HH)。MIBK可溶性级分及MIBK不溶性级分是指分别通过与PHA级分(I)或PHA级分(II)相同的方法得到的埃尔门多夫撕裂强度为很低的值。在PHA级分(I)的3HH的平均组成比率不为20摩尔％以上[0002]<110>株式会社钟化(KanekaCorporation)[0003]<120>共聚聚羟基烷酸酯混合物的制造方法、以及转化微生物[0004]<130>B200181[0006]<170>PatentInversion3.5[0010]<213>豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)MetSerGlnProSerTyrGlyProLeuPheGluAlaLeuAlaHisTyr15AsnAspLysLeuLeuAlaMetAlaLysAlaGlnThrGluArgThrAlaGlnAlaLeuLeuGlnThrAsnLeuAspAspLeuGlyGlnValLeuGlu4045GlnGlySerGlnGlnProTrpGlnLeuGlnAlaGlnMetAsnTrpTrpGlnAspGlnLeuLysLeuMetGlnHisThrLeuLeuLysSerAlaGlyGlnProSerGluProValThrProGluArgSerAspArgArgPheLysAlaGluAlaTrpSerGluGlnProTyrAspTyrLeuLysGlnSerTyrLeuLeuThrAlaArgHisLeuLeuAlaSerValAspAlaLeuGluGlyValProGlnLysSerArgGluArgLeuArgPhePheThrArgGlnTyrValAsnAlaMetAlaProSerAsnPheLeuAlaThrAsnProGluLeuLeuLysLeuThrLeuGluSerAspGlyGlnAsnLeuValArgGlyLeuAlaLeuLeuAlaGluAspLeuGluArgSerAlaAspGlnLeuAsnArgLeuThrAspGluSerAlaPheGluLeuGlyArgAsp200205LeuAlaLeuThrProGlyArgValValGlnArgThrGluLeuTyrGlu210215220LeuGlnTyrSerProThrThrGluThrValGlyLysThrProVal225230235240LeuValProPro245PheAsnLysTyr250TyrMetAspMet255ArgProGlnAsnSer260LeuValAlaTrpLeu265ValAlaGlnGlyGln270ThrValPheMet275SerTrpArgAsnPro280GlyValAlaGlnAla285GlnAspLeuAsp290AspTyrValValAsp295GlyValAlaAlaLeuAspGlyValGluAlaAlaThrGlyGluArgGluValHisGlyGlyTyrCysGlyGlyThrAlaLeuSerLeuAlaMetGlyTrpLeuAlaAlaArgArgGlnLysGlnArgValArgThrAlaThrLeuPheThrThrLeuLeuAspPheSerGlnProGlyGluLeuGlyPheHisGluProAlaAlaLeuGluAlaGlnAsnGluAlaLysGlyMetAspGlyArgGlnLeuAlaValSerPheSerLeuLeuArgGluAsnSerLeuTyrTrp400AsnTyrTyrAsp405SerTyrLeuLysGly410GlnSerProValAla415PheAspLeuLeuHis420TrpAsnSerAspSer425ThrAsnValAlaGly430LysThrHisAsnSer435LeuLeuArgArgLeu440TyrLeuGluAsnGln445LeuValLysGlyGlu450LeuLysArgAsn455ThrArgAspLeu460GlyLysValLysThr465ProValLeuLeuVal470SerAlaValAspAsp475HisAlaLeuTrp480GlnGlyThrTrpGln485GlyMetLysLeuPhe490GlyGlyGluGlnArg495PheLeuLeuAlaGluSerGlyHisAlaGlyAsnProProAlaAlaAsnLysTyrGlyPheTrpHisAsnGlyAlaGluAlaGluSerProGluSerTrpLeuAlaGlyAlaThrHisGlnGlyGlySerTrpTrpProGluMetMetGlyPheGlnAsnArgAspGluGlySerGluProValProAlaArgValProGluGluGlyLeuAlaProAlaProGlyHisTyrValProValPheAlaArgLeuValProValPheAlaArgLeuAsnCysProThrGluGluAspAlaAla<210>2<211>594<212>PRT<213>豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)<400>2GlnPheMetSerSerTyrProGlnPheMetSerSerTyrProLeuGluAlaLeuAlaHisTyr55LeuAlaAlaMetAlaLysLeuLeuAlaAlaMetAlaLysLeuLysGlnThrGluArgThrAlaGlnAlaAsnLeuAspAspLeuGlnAlaAsnLeuAspAspLeuLeuLeuGlyGlnValLeuGlu4045GlnGlnProTrpGlnSerGlnGlnProTrpGlnSerLeuGlnAlaGlnMetAsnTrpGlnGlnAspHisLeuLysLeuGlnGlnAspHisLeuLysLeuMetThrLeuLeuLysSerAlaValIleGluProThrSerProValIleGluProThrSerProProGluArgSerAspArgArgAlaGluPheLysSerGluGlnAlaGluPheLysSerGluGlnProTyrAspTyrLeuLysLeuThrGlnSerHisTyrLeuLeuThrGlnSerHisTyrLeuLeuLeuAlaSerValAspAlaGlyValProGlnGluArgLeuGlyValProGlnGluArgLeuGluArgLeuArgPhePheThrValSerAlaMetAlaSerTyrValSerAlaMetAlaSerTyrProAsnPheLeuAlaThrAsnProGluGluSerLeuLeuThrProGluGluSerLeuLeuThrLeuGlyGlyGlnAsnLeuValAlaAlaGluAspLeuLeuLeuAlaAlaGluAspLeuLeuLeuLeuGluArgSerAlaAspGlnLeuThrAlaLeuAsnArgLeuThrAlaLeuAsnArgSerPheGluLeuGlyArgAsp200205LeuAlaThrArgValValGlnLeuAlaThrArgValValGlnLeuArgThrGluLeuTyrGlu210215210220GlnThrThrGluThrSerProGlnThrThrGluThrSerProTyrValGlyLysThrProVal225230225235240IleAsnValProPheProLysIleAsnValProPheProLysTyrTyrMetAspMetArg245250245255ProGlnLeuValValAsnSerProGlnLeuValValAsnSerLeuAlaGlnGlyGlnThrVal260265260270[0126]PheMetIleSerTrpArgAsnProGlyValAlaGlnAlaGlnIleAsp[0128]LeuAspAspTyrValValAspGlyValIleAlaAlaLeuAspGlyVal[0130]GluAlaAlaThrGlyGluArgGluValHisGlyIleGlyTyrCysIle[0132]GlyGlyThrAlaLeuSerLeuAlaMetGlyTrpLeuAlaAlaArgArg[0134]GlnLysGlnArgValArgThrAlaThrLeuPheThrThrLeuLeuAsp[0136]PheSerGlnProGlyGluLeuGlyIlePheIleHisGluProIleIle[0138]AlaAlaLeuGluAlaGlnAsnGluAlaLysGlyIleMetAspGlyArg[0140]GlnLeuAlaValSerPheSerLeuLeuArgGluAsnSerLeuTyrTrp[0142]AsnTyrTyrIleAspSerTyrLeuLysGlyGlnSerProValAlaPhe[0144]AspLeuLeuHisTrpAsnSerAspSerThrAsnValAlaGlyLysThr[0146]HisAsnSerLeuLeuArgArgLeuTyrLeuGluAsnGlnLeuValLys[0148]GlyGluLeuLysIleArgAsnThrArgIleAspLeuGlyLysValLys[0150]ThrProValLeuLeuValSerAlaValAspAspHisIleAlaLeuTrp[0152]GlnGlyThrTrpGlnGlyMetLysLeuPheGlyGlyGluGlnArgPhe[0154]LeuLeuAlaGluSerGlyHisIleAlaGlyIleIleAsnProProAla[0156]AlaAsnLysTyrGlyPheTrpHisAsnGlyAlaGluAlaGluSerPro[0158]GluSerTrpLeuAlaGlyAlaThrHisGlnGlyGlySerTrpTrpPro[0160]GluMetMetGlyPheIleGlnAsnArgAspGluGlySerGluProVal[0162]ProAlaArgValProGluGluGlyLeuAlaProAlaProGlyHisTyr[0164]ValLysValArgLeuAsnProValPheAlaCysProThrGluGluAsp[0170]<213>豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)MetSerGlnProSerTyrGlyProLeuPheGluAlaLeuAlaHisTyr15AsnAspLysLeuLeuAlaMetAlaLysAlaGlnThrGluArgThrAlaGlnAlaLeuLeuGlnThrAsnLeuAspAspLeuGlyGlnValLeuGlu4045GlnGlySerGlnGlnProTrpGlnLeuGlnAlaGlnMetAsnTrpTrpGlnAspGlnLeuLysLeuMetGlnHisThrLeuLeuLysSerAlaGlyGlnProSerGluProValThrProGluArgSerAspArgArgPheLysAlaGluAlaTrpSerGluGlnProTyrAspTyrLeuLysGlnSerTyrLeuLeuThrAlaArgHisLeuLeuAlaSerValAspAlaLeuGluGlyValProGlnLysSerArgGluArgLeuArgPhePheThrArgGlnTyrValSerAlaMetAlaProSerAsnPheLeuAlaThrAsnProGluLeuLeuLysLeuThrLeuGluSerGlyGlyGlnAsnLeuValArgGlyLeuAlaLeuLeuAlaGluAspLeuGluArgSerAlaAspGlnLeuAsnArgLeuThrAspGluSerAlaPheGluLeuGlyArgAsp200205LeuAlaLeuThrProGlyArgValValGlnArgThrGluLeuTyrGlu210215220LeuGlnTyrSerProThrThrGluThrValGlyLysThrProVal225230235240LeuValProProPheAsnLysTyrTyrMetAspMetArg245250255ProGlnAsnSerLeuValAlaTrpLeuValAlaGlnGlyGlnThrVal260265270PheMetSerTrpArgAsnProGlyValAlaGlnAlaGlnAsp275280285LeuAspAspTyrValValAspGlyValAlaAlaLeuAspGlyVal290295GluAlaAlaThrGlyGluArgGluValHisGlyGlyTyrCysGlyGlyThrAlaLeuSerLeuAlaMetGlyTrpLeuAlaAlaArgArgGlnLysGlnArgValArgThrAlaThrLeuPheThrThrLeuLeuAspPheSerGlnProGlyGluLeuGlyPheHisGluProAlaAlaLeuGluAlaGlnAsnGluAlaLysGlyMetAspGlyArgGlnLeuAlaValThrPheSerLeuLeuArgGluAsnSerLeuTyrTrp400AsnTyrTyrAspSerTyrLeuLysGlyGlnSerProValAlaPhe405410415AspLeuLeuHisTrpAsnSerAspSerThrAsnValAlaGlyLysThr420425430HisAsnSerLeuLeuArgArgLeuTyrLeuGluAsnGlnLeuValLys435440445GlyGluLeuLysArgAsnThrArgAspLeuGlyLysValLys450455460ThrProValLeuLeuValSerAlaValAspAspHisAlaLeuTrp465470475480GlnGlyThrTrpGlnGlyMetLysLeuPheGlyGlyGluGlnArgPhe485490495LeuLeuAlaGluSerGlyHisAlaGlyAsnProProAlaAlaAsnLysTyrGlyPheTrpHisAsnGlyAlaGluAlaGluSerProGluSerTrpLeuAlaGlyAlaThrHisGlnGlyGlySerTrpTrpProGluMetMetGlyPheGlnAsnArgAspGluGlySerGluProValProAlaArgValProGluGluGlyLeuAlaProAlaProGlyHisTyrValLysValArgLeuAsnProValPheAlaCysProThrGluGluAspAlaAla<210>4[0250]<213>色杆菌(Chromobacteriumsp.)Met1GlnGlnPheVal5AsnSerLeuSerLeuGlyGlnAspGlnSerAspAlaProHisProLeuThrGlyAlaTrpSerGlnLeuMetSerGlnThrAsnGlnLeuLeuGlnLeuGlnSer40SerLeuTyrGlnGln45GlnLeuGlyLeuTrpThrGlnPheLeuGlyGlnThrAlaGlyAsnAspAlaSerAlaProSerAlaLysProSerAspArgArgPheAlaSerProGluTrpAspGluHisProPheTyrSerPheLeuLysGlnSerTyrLeuGlnThrSerLysTrpMetMetGluLeuValAspLysThrGlnAspGluSerAlaLysAspLysLeuSerPheAlaThrArgGlnTyrLeuAspAlaMetAlaProSerAsnPheMetLeuThrAsnProAspValValLysArgAlaGluThrGlnGlyGluSerLeuValGluGlyMetLysAsnMetMetGluAspGlnLysGlyHisSerMetSerAspGluSerLysPheGlnGlyLysAsnLeuValValThrProGlyGluValValPheArgAsnGluLeuGluLeuGlnTyr200ThrProThrThrGlu205LysValHisGluLys210ProLeuLeuPheVal215ProProCysAsn220LysTyrTyrLeuMet225AspLeuGlnProAsp230AsnSerMetValArg235HisPheValGlyGln240GlyTyrArgValPhe245LeuValSerTrpArg250SerAlaValProGlu255MetLysAsnPheThr260TrpGluThrTyr265GluLysGlyValPhe270AlaAlaAlaGluAla275ValGlnLysThr280LysGlnProThrMet285AsnAlaLeuGlyPhe290CysValGlyGlyVal295LeuThrThrAlaLeuCysValAlaGlnAlaLysGlyLeuLysTyrPheAspSerAlaThrPheMetThrSerLeuAspHisAlaGluProGlyGluSerPhePheAspGluAlaAlaValSerArgLeuGluAlaAlaAlaValSerArgLeuMetAlaAlaGlyGlyGlyGluSerLysArgThrGlyGluSerLysAlaSerLeuArgAlaAsnAspValTyrValAsnLeuTrpValAsnValTyrValAsnLeuTrpTyrLeuLeuGlyLysThrProAlaPheAspProLeuLeuTyrTrpAlaPheAspProLeuLeuAsnAspAlaValAspLeuPro400ThrPheHisLeuProMetMetLeuThrPheHisLeuProMetGlnPheTyrAsnAsnAla405410415GlyAlaThrLeuProIleThrGlyAlaThrLeuProCysGlyValProAsp420425420430AspSerLysValTyrAspSerLysPheAlaAlaArgGluAspHis435440435445ValSerSerLeuTrpAlaTyrValSerSerLeuTrpGlyLeuLysTyrLeuSerGly450455450460ThrArgPheArgSerProValLeuThrArgPheArgSerProAlaSerGlyHisMetGly470465470475480AsnValThrSerProLysAspAsnValThrSerProArgAsnTyrTrpThrAsnGlu485490495ValGlnAsnProLeuProGluGluValGlnAsnProLeuProLeuGluGlyAlaGlnSerHisGlySerProTrpTrpLysAspTrpGlySerProTrpTrpLysAlaTrpLeuAlaProGlnSerGlnValGlyLysProAlaProLysGlnValGlyLysProAlaLeuGlySerLysGluPheProGlnAlaProProLeuProGlySerGlnAlaProProLeuProValLeuAlaLysAlaMetProAlaAlaValAsnProAlaLeuAlaAlaValAsnPro<210>5<211>567<212>PRT<213>色杆菌(Chromobacteriumsp.)<400>5GlnPheGlnValAsnMetSerLeuGlnPheGlnValAsnMetLeuGlyGlnAspGlnSerAsp5AlaLeuThrHisProProGlyAlaAlaLeuThrHisProProSerGlnLeuMetSerGlnThrGlnGlnLeuAsnLeuLeuGlnSerGlnGlnLeuAsnLeuLeuLeuTyrGlnGlnGlnLeuGly4045ThrGlnPheLeuLeuTrpGlyGlnThrGlnPheLeuLeuTrpAlaGlyAsnAspAlaSerAlaProSerAlaLysProSerAspArgArgPheAlaSerProGluTrpAspGluHisProPheTyrSerPheLeuLysGlnSerTyrLeuGlnThrSerLysTrpMetMetGluLeuValAspLysThrGlnAspGluSerAlaLysAspLysLeuSerPheAlaThrArgGlnTyrLeuAspAlaMetAlaProSerAsnPheMetLeuThrAsnProAspValValLysArgAlaGluThrGlnGlyGluSerLeuValGluGlyMetLysAsnMetMetGluAspGlnLysGlyHisSerMetSerAspGluSerLysPheGlnGlyLysAsnLeuValValThrProGlyGluValValPheArgAsnGluLeuGluLeuGlnTyr200ThrProThrThrGlu205LysValHisGluLys210ProLeuLeuPheVal215ProProCysAsn220LysTyrTyrLeuMet225AspLeuGlnProAsp230AsnSerMetValArg235HisPheValGlyGln240GlyTyrArgValPhe245LeuValSerTrpArg250SerAlaValProGlu255MetLysAsnPheThr260TrpGluThrTyr265GluLysGlyValPhe270AlaAlaAlaGluAla275ValGlnLysThr280LysGlnProThrMet285AsnAlaLeuGlyPhe290CysValGlyGlyVal295LeuThrThrAlaLeuCysValAlaGlnAlaLysGlyLeuLysTyrPheAspSerAlaThrPheMetThrSerLeuAspHisAlaGluProGlyGluSerPhePheAspGluAlaLeuValAlaSerArgGluAlaLysMetAlaAlaGlyGlySerGlyLysGluGlyArgThrPheAlaSerLeuArgAlaAsnAspLeuValTrpAsnTyrValValAsnAsnTyrLeuLeuGlyLysThrProAlaProPheAspLeuLeuTyrTrpAsnAsnAspAlaValAspLeuPro400ProLeuMetProLeuHisThrPheMetLeuArgGlnPheTyrAsnAsnAla405410415ThrLeuThrLeuProGlyAlaThrLeuCysGlyValProAsp420425430SerLysSerLysAspProValTyrMetPheAlaAlaArgGluAspHis435440445ValLeuValLeuTrpSerSerAlaTyrSerGlyLeuLysTyrLeuSerGly450455460SerProThrSerProArgArgPheValLeuGlyAlaSerGlyHisGlyGly46547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