液体活检主要生物标志物在结直肠癌中的研究进展总结2026

液体活检主要生物标志物在结直肠癌中的研究进展总结2026结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤，也是我国常见消化道恶性肿瘤之一。流行病学资料显示，我国结直肠癌发病率仍呈上升趋势。结直肠癌位居新发恶性肿瘤前列，并列入癌症死亡前五位［1］。与此同时，我国结直肠癌筛查仍面临发现偏晚和依从性不足等问题，导致总体预后仍不理想。传统常用筛查和评估手段包括结肠镜、影像学检查及血清肿瘤标志物检测，其中结肠镜因侵入性强，导致患者依从性受限，在我国人群中的覆盖率仍不足。因此，开发安全、便捷且敏感度高的无创检测方法，对提高早筛效率和改善预后具有重要意义，见表1。近年来，液体活检逐渐应用于结直肠癌研究。该技术以体液为样本，通过检测循环肿瘤细胞（circulatingtumorcells，CTCs），循环肿瘤DNA（circulatingtumorDNA，ctDNA）和肿瘤教化血小板（tumor-educatedplatelets，TEPs）等生物标志物，可在一定程度上实现结直肠癌的早期筛查、诊断和动态监测［2］，见表2、图1。本文主要围绕CTCs、ctDNA及TEPs三类当前研究较多的液体活检标志物，综述其在结直肠癌中的临床应用进展。表1

液体活检和传统组织活检的比较表2

液体活检的特点一、结直肠癌中的CTCs1.CTCs的特性及其检测方法CTCs是由原发灶或转移灶脱落进入循环的肿瘤细胞，是液体活检的重要靶标，在结直肠癌的早期诊断、预后判断和转移机制研究中具有潜在价值。其检测面临的主要困难在于血液中丰度较低、半衰期较短［3］。结直肠癌进展过程中常发生上皮—间质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT），会使上皮细胞黏附分子（epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM）等上皮标志物表达下调，进一步增加了识别和捕获难度。循环中的CTCs可呈单细胞或细胞簇形式存在，其中异型CTCs簇可能具有更强的转移潜能［4］，但其临床诊断价值仍有待证实。CTCs检测的重点在于提高富集效率与识别准确率。目前，相关技术大致可分为两类［5］。一是通过免疫学特征分离。以美国食品药品监督管理局（FDA）批准的CellSearch系统为代表，该方法利用EpCAM抗体包被磁珠进行阳性富集［6］。多项研究提示，这类方法具有一定临床应用价值。例如，术前CTCs计数（≥1/7.5mL）被认为是Ⅰ~Ⅳ期预后不良结直肠癌患者的无进展生存期、总生存期的独立预测因素［7］。不过，这类免疫富集技术对单一上皮标志物依赖较高。发生EMT后，部分CTCs的上皮标志物表达会减弱，捕获效率也可能随之下降，因此可能会漏检掉这类更具侵袭性的CTCs。为弥补上述不足，微流控平台如CTC-Chip［8］和垂直层流堆叠芯片［9］尝试通过优化流体结构、延长细胞与抗体接触时间，或联合多靶点与生物物理参数进行富集，这在一定程度上提高了捕获率，也减少了对单一标志物的依赖，但是仍不可避免的混入白细胞和丢失目标细胞。二是通过物理性质的分离策略，如上皮肿瘤细胞大小分离技术等，主要利用CTCs与血细胞在体积和密度上的差异进行筛选，可部分绕开EpCAM依赖。近年引入金、磁性或二氧化硅等纳米材料后，CTCs捕获效率有所改善。总体来看，物理分离方法对EMT后的CTCs相对更友好，样本处理量也较大，但富集纯度仍有限，这会对后续分子分析和功能研究造成影响。目前，多标志物联合分析正受到越来越多的关注。在CTCs、ctDNA和TEPs的联合检测中，ctDNA更适用于揭示肿瘤的突变信息，CTCs可提供活细胞形态与功能特征，TEPs则主要反映肿瘤与宿主微环境的相互作用。研究提示，这类联合策略有助于提高早期检出和预后评估的准确性［10］。Gao等［11］选取93例结直肠癌患者和96例健康对照，通过构建多组学综合模型，获得的曲线下面积（areaunderthecurve，AUC）为0.981（95%CI：0.965~0.998），敏感度为92.1%（95%CI：84.5%~96.8%），特异度为94.7%（95%CI：88.1%~98.3%），其诊断效能优于单一组学特征。后续研究需继续完善整合检测方案，如引入物理分离、多靶标免疫富集与功能分析等手段，并配套稳定可靠的数据分析流程，以促进其临床转化。2.CTCs用于结直肠癌的筛查和早期诊断目前，临床诊断结直肠癌仍主要依靠结肠镜和影像学检查，但这些方法对部分早期病变的识别仍有限。研究显示，Ⅰ~Ⅱ期结直肠癌患者的5年生存率可达90%以上，Ⅳ期则不足15%［12］，因此，提高早筛效率对改善患者预后具有重要意义。CTCs检测取样相对方便，创伤小，为提高早期筛查依从性和诊断准确性提供了新的可能。现有研究也提示，CTCs在早期诊断中具有一定潜力。例如，纳米检测法［13］以1.5CTCs/mL为临界值时，敏感度为84.6%，特异度为94.8%；当免疫荧光法（EpCAM/PDPN）［14］以23EpCAM+CTCs/mL为临界值时，敏感度和特异度分别为85.3%和78.5%，以7PDPN+CTCs/mL为临界值时二者分别为78.0%和75.4%；另有研究通过联合术前检测，将敏感度提高至95.2%［15］。目前来说，不同平台在早期识别上均显示出一定潜力，但各研究采用的阳性阈值不同，临界值设定差异较大，方法学不统一，是CTCs走向临床应用的重要障碍。今后还需在检测流程、结果判读和阳性标准等方面形成较为一致的规范。除单独检测外，CTCs与其他指标联合，可进一步改善筛查效能。例如，CTCs计数与癌胚抗原（carcinoembryonicantigen，CEA）、粪便免疫化学试验（fecalimmunochemicaltest，FIT）联合时，检出效能可有所提升［14］。Bahnassy等［16］将CTC-mRNA标志物纳入分析后，敏感度和特异度分别达到68.3%和95.0%；Li等［17］在此基础上通过结合mRNA定量与机器学习，敏感度和特异度分别提高至91.9%和90.0%。不过，联合策略并不能忽视CTCs本身检测性能的优化，真实筛查效能仍要在前瞻性队列中进一步证实。总体上，CTCs目前仍难以作为一般人群结直肠癌的大规模独立筛查工具，主要限制因素在于早期患者CTCs血液丰度低、检测敏感度有限以及成本效益不足等。3.CTCs用于结直肠癌患者预后的监测微小残留病变（minimalresidualdisease，MRD）是术后复发的重要原因，所以术后动态监测就很重要。CTCs在MRD评估和复发风险判断中具有一定参考价值。有前瞻性研究［18］发现，接受完全减瘤治疗的患者若CTCs阳性，往往提示体内仍存在微小残留病灶，这部分患者可能从后续辅助治疗中获得更多益处。相关荟萃分析也指出，CTCs阳性与较差的总生存期及更高的复发风险相关［19］。还有部分研究认为，与术前检测相比，术后CTCs检测可能更能反映患者的复发风险，尤其是术后1周左右的检测结果更值得重视［20］。不过这也可能是术后急性期反应或者手术操作引起的肿瘤细胞短期释放导致，所以稳定性和适用范围还不明确。除了复发监测，CTCs数量的动态变化还可能反映治疗反应。以Aranda等［21］研究为例，他们通过纳入既往未经治疗、不可切除的转移性结直肠癌患者，且入组患者CTCs水平为≥3CTCs/7.5mL，发现FOLFOXIRI贝伐珠单抗组的中位无进展生存期为12.4个月（95%CI：11.2~14.0），优于FOLFOX联合贝伐珠单抗组的9.3个月（95%CI：8.5~10.7）。这说明，CTCs计数可能作为一种分层指标，帮助筛选更适合接受强化一线治疗的患者。但需要注意的是，他们主要针对的是强化一线治疗人群，还不能直接推广到更广泛的结直肠癌患者。此外，检测频率增加带来的成本问题也限制了下一步的推广。4.临床启示CTCs在结直肠癌中的主要价值在预后分层、复发风险评估和动态随访上。相比其他液体标志物，CTCs能够提供细胞形态和部分功能学信息。不过，由于外周血中CTCs本身丰度低、异质性强和EMT的影响，以及各种检测平台和阳性判读标准还没有统一，CTCs现阶段还无法用于一般人群的筛查，也不适合单独作为临床决策的依据。就目前来看，更适合把它当成一种补充性标志物，与ctDNA、影像学检查和临床病理指标一起使用。二、结直肠癌中的ctDNA1.ctDNA的特性及其检测方法ctDNA是肿瘤细胞凋亡或坏死过程中释放入血的无细胞DNA片段。其甲基化异常是最常见的表观遗传学改变，通过分析ctDNA，可在一定程度上反映肿瘤突变谱，因此在结直肠癌的早期诊断、分子分型和复发风险评估中具有重要价值。ctDNA半衰期短，其定量变化可较快反映疾病进展，因此对检测技术敏感度要求较高［22］。目前常用检测方法主要是两类。一是聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）相关方法。扩增阻滞突变系统PCR（amplificationrefractorymutationsystempolymerasechainreaction，ARMS-PCR）、数字PCR（digitalpolymerasechainreaction，dPCR）和微滴式数字PCR（dropletdigitalpolymerasechainreaction，ddPCR）等技术显示出良好应用前景［23］。二是下一代测序（next-generationsequencing，NGS）。与PCR方法相比，NGS不仅可检测已知突变，还可识别未知变异［24］，见表3。在NGS策略中，肿瘤知情分析（tumor-informedanalysis）通常需要先对患者肿瘤组织进行测序，再据此设计个体化Panel以追踪特异性体细胞突变。这种方案在MRD监测中往往会更敏感，但流程较繁琐，成本和周转时间也相对较高，因此更适用于术后复发监测。肿瘤不可知分析（tumor-agnosticanalysis）则多采用固定Panel检测常见突变或表观遗传学标志物，实施更便捷，可及性也就更好，因而更适合筛查和未知癌症检测场景，但对低频变异和个体特异性改变的识别能力仍有限［25］。近年来，通过全基因组测序的肿瘤知情技术也受到关注。MONSTAR-SCREEN-3平台［26］就是通过超高深度测序来提高ctDNA的检出率，更适合用在术后早期等肿瘤脱落负荷较低时。需要指出的是，这类技术的成本效益和现实可推广性仍不明确。总体上，尽管ctDNA检测技术在不断进步，但对极早期腺瘤或Ⅰ期结直肠癌的无创检出率仍不理想；同时，从样本采集、处理到DNA提取的各个环节，不同平台和实验室之间仍存在明显差异，这也是阻碍临床推广的重要原因。表3

ctDNA分析中ddPCR和NGS技术比较2.ctDNA用于结直肠癌的筛查和早期诊断ctDNA源于凋亡坏死癌细胞的DNA片段，携有体细胞突变信息，其丰度与肿瘤大小和分期密切相关。现有研究提示，ctDNA在结直肠癌早期筛查中具有一定应用潜力，其中DNA甲基化异常是最受关注的早期标志物，见表4。在一项纳入742名参与者的研究中［27］，单一ctDNA甲基化标志物SEPT9用于检测结直肠癌和癌前病变时，特异度为91.9%，敏感度为83.6%；Liu等［28］在多癌种研究中发现，ctDNA甲基化检测的敏感度随分期变化而升高：Ⅰ期为39%（95%CI：27%~52%），Ⅱ期为69%（95%CI：56%~80%），Ⅲ期为83%（95%CI：75%~90%），Ⅳ期为92%（95%CI：86%~96%）。这说明ctDNA甲基化检测具有一定早诊潜力，但在早期病变中的检出能力仍有待提高。还需注意的是，目前较高的敏感度数据主要来自病例对照研究，研究对象多是已有症状或已经确诊的患者，但是在真正的无症状平均风险筛查人群中，早期病变比例会更高、ctDNA丰度更低，实际检测效能可能低于已报道结果。表4中不同标志物敏感性差异较大，也提示研究人群构成、样本处理流程及检测平台差异都会影响结果。因此，未来仍需在前瞻性队列中验证其临床实用性。表4

ctDNA甲基化标志物在结直肠癌早期检测中的应用注：“-”原始研究中未提及敏感度、特异度或AUC；AUC：ROC曲线下面积。表格数据来源于不同研究，其敏感度和特异度受研究人群特征、样本量大小、检测方法等多种因素影响联合多个甲基化标志物是提高筛查效能的重要方向。Xu等［29］检测Septin9、Syndecan-2（SDC2）和支链氨基酸转氨酶1（branched-chainamino-acidtransaminase1，BCAT1）三个基因甲基化，并采用Logistic回归构建综合评分模型，使敏感度和特异度分别达到82.7%和96.9%。可见，借助多基因整合策略，ctDNA甲基化检测在特定筛查场景下具备一定的应用潜力。现阶段，更可能适用于：结肠镜检查依从性不佳或存在禁忌证者，作为替代或补充手段；粪便免疫化学试验阳性人群的分流，以辅助判断是否需要下一步接受结肠镜检查；以及遗传性高风险人群更频繁的无创监测。今后，继续筛选并优化多甲基化基因组合，可能是提高筛查效能的重要方向。3.ctDNA用于结直肠癌患者预后的监测ctDNA状态是预测结直肠癌复发风险的重要指标，由于其在循环中的半衰期较短（约16min~2.5h），定量变化可较快反映疾病进展，因此可用于复发监测和疗效评估。多项研究证实［35-36］，术后4周ctDNA阳性，与较高复发风险相关，是结直肠癌复发的较强独立风险因素，预测价值高于传统临床病理因素。ctDNA阳性患者的复发风险是阴性患者的数倍，有研究显示HR高达7.27，可比影像学检查提前9个月预警复发［37］。因此，ctDNA阳性提示患者可能具有较高复发风险，应考虑加强随访，而持续阴性则提示复发风险较低，可避免过度治疗。此外，ctDNA的动态变化还可作为实时药效学生物标志物，用于早期评估治疗反应、预测耐药并辅助调整治疗方案，在靶向治疗和免疫治疗中具有潜在价值。Tie等［38］开展的前瞻性随机对照试验证实，在Ⅱ期结肠癌中，与单纯依据临床病理因素决策相比，ctDNA指导组减少了不必要的化疗，而3年无复发生存（relapsefreesurvial，RFS）并未降低，达到86.4%，这提示ctDNA正由单纯预后标志物逐步转向治疗决策生物标志物，可有望减少ctDNA阴性低危患者的过度治疗，同时帮助ctDNA阳性高危患者更早接受强化干预。当然，最佳检测时机和监测频率目前仍缺乏统一标准，仍需进一步研究。4.临床启示在目前几类液体活检标志物中，ctDNA在结直肠癌领域证据积累相对更多。它的主要优势是能比较灵敏地反映肿瘤分子残留状态和动态变化，因而在术后MRD监测、复发预警、辅助治疗决策及疗效评估这几个场景中，应用价值更高。就目前来看，把ctDNA定位成结直肠癌现有诊疗体系的补充工具更现实，优先用于术后监测、复发预警和分层随访。三、结直肠癌中的TEPs1.TEPs的特性及其检测方法除参与止血外，血小板在肿瘤微环境中也发挥重要作用。肿瘤细胞可通过释放信号分子或直接接触“教化”血小板，改变其RNA谱和蛋白质组，形成TEPs。TEPs作为新兴的液体活检标志物，取样方便，常规离心就能富集；同时，其RNA稳定性较高，体内半衰期约为3d~5d。TEPs不仅携带肿瘤相关分子信息，还可在一定程度上反映肿瘤细胞与宿主之间的动态互作。针对TEPs的检测，主要围绕其RNA组分展开，常用方法大致分为三类：（1）高通量测序（high-throughputsequencing，HTS）：以ThromboSeq平台［39］为代表，可对TEPs进行全转录组分析，并在此基础上构建诊断分类模型。In’tVeld等［40］应用该平台对18种癌症进行检测，特异度达99%，对结直肠癌的检出率为66.7%。（2）靶向检测：以RT-qPCR为代表。（3）整合分析策略：有研究尝试将RNA-seq与算法模型结合起来，通过优选标志物建立分类模型来改善检测效能［41,42,43］。已有报道指出，部分流程可在48h内完成微量样本处理，并取得较好的分类效果［44］。与CTCs和ctDNA相比，TEPs相关研究仍处于起步阶段。其预处理、检测和结果分析还缺少统一标准，多个技术环节都可能影响结果的重复性与稳定性。再加上目前缺乏大样本前瞻性队列支持，TEPs距离临床转化仍有较长距离。2.TEPs用于结直肠癌的筛查和早期诊断目前，TEPs相关研究主要集中在RNA和蛋白质组分析。RNA-seq发现，结直肠癌患者TEPs的mRNA谱可用于区分结直肠癌与非肿瘤性肠道疾病，提示其具有一定早期诊断价值。Xu等［45］对132例结直肠癌患者和190例对照者血小板进行转录组测序，采用留一法交叉验证得到的AUC为0.928，诊断表现优于临床常用血清生物标志物CEA和CA19-9。Ye等［46］在另一项病例对照研究中验证了血小板相关lncRNA的诊断性能，其Logistic模型AUC为0.78，这些结果提示，对于TEPsRNA特征的分析在结直肠癌无创诊断中具有一定潜力。除mRNA和lncRNA外，TEPs中miRNA变化也可能与疾病状态相关。血小板活化后，其miRNA表达谱会发生动态变化，这类变化或可为肿瘤诊断和病程评估提供补充信息。例如，在鼻咽癌中，miR-34c-3p和miR-18a-5p表达明显升高［47］；在结直肠癌中，miR-24、miR-19a也被认为具有一定潜在价值［48］。此外，TEPs蛋白质组学同样可用于早期筛查。肿瘤微环境可改变血小板蛋白表达，结直肠癌患者血小板中血小板衍生生长因子、血小板因子-4和血管内皮生长因子等水平升高，三者联合区分结直肠癌的AUC为0.893（P＜0.001）［49］。不过，肿瘤如何重塑血小板蛋白质组，目前机制仍不清楚；且现有研究多为病例对照设计，临床应用价值仍有待验证。3.TEPs用于结直肠癌患者预后的监测TEPs可能是结直肠癌的潜在预后标志物。血小板可参与肿瘤生长、血管生成、免疫逃逸和转移等过程影响疾病结局。研究发现［50］，血小板与肿瘤细胞之间可通过特定受体或细胞外蛋白直接或间接作用，进而促进肿瘤进展。在肿瘤细胞诱导血小板聚集过程中，血小板释放的颗粒物质可进一步促进肿瘤生长和转移。相关机制研究显示，在小鼠MC38结直肠癌模型中，血小板膜包裹纳米颗粒具有较好的肿瘤局部滞留和免疫激活作用，可促进抗原呈递和CD8+T细胞浸润。由此可见，血小板相关生物学不仅与结直肠癌进展有关，也可能为治疗靶向和预后评估提供参考［51］。TEPs在肿瘤转移监测中的价值正日益受到重视。TEPs可通过引发凝血级联反应，在CTCs表面形成富含血小板的凝块。这种凝块既可协助CTCs逃避机体免疫清除，又有助于其存活并提升转移定植能力［52］。Kassassir等［53］的研究发现，结直肠癌细胞能摄取血小板来源的微粒，继而引起MMP-2和MMP-9等侵袭相关分子表达上调，最终使肿瘤细胞侵袭力增强。这提示，靶向血小板相关通路的干预策略可能有助于降低肿瘤负荷［54］。但须指出，TEPs在疾病进展监测中的实际准确性仍受制于检测敏感度、采样时间窗以及分析流程标准化等多重因素，现阶段难以直接用于常规临床监测。血小板计数升高与结直肠癌的侵袭、转移及生存率下降相关。Li等［55］研究表明，TEPs升高可通过PSGL-1/JNK/STAT1信号通路激活肿瘤相关巨噬细胞中的C5a/C5aR1轴，进而促进结直肠癌生长和转移，为TEPs作为预后标志物提供了生物学解释。血小板相关炎症指标同样显示出一定预后价值。Abdallah等［56］在69例Ⅰ~Ⅲ期结直肠癌患者中发现，术前高血小板与淋巴细胞比值（platelet-to-lymphocyteratio，PLR）＞124者中75.6%为高危Ⅱ/Ⅲ期癌症患者，且8例复发者均伴有高PLR。但该研究样本量较小，随访时间较短，结论仍需在更大规模队列研究中验证。Chen等［57］在1163例结直肠癌患者的回顾性研究中发现，PLR预测预后的AUC为0.677（95%CI：0.642~0.713），提示其具有一定相关性，但预测效能有限，也容易受到非肿瘤因素影响，尚不足以独立指导临床决策。后续仍需通过更大样本研究明确其预后价值，并深入探讨高PLR与转移风险之间可能存在的机制联系。4.临床启示作为新兴液体活检标志物，TEPs在结直肠癌无创诊