（正式版）DB31∕T 1287-2021 《实验东方田鼠病原学等级及监测》

上海市地实验东方田鼠病原学等级及监测2021-02-01发布2021-05-01实施上海市市场监督管理局发布I 2规范性引用文件 13术语和定义 14缩略语 25东方田鼠病原学等级 26检测指标 36.1外观要求 36.2病原学检测项目 37检测程序 38检测方法 9监测规则 9.1检测频率 9.2采样要求 49.3样本采集 10结果判定 5 5附录A(规范性)实验东方田鼠病原体PCR检测方法 6参考文献 9Ⅲ起草。本文件起草单位：上海实验动物研究中心、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心。1实验东方田鼠病原学等级及监测本文件规定了实验东方田鼠(Microtusfortis)病原学等级及监测，包括实验东方田鼠病原学等级、本文件适用于实验东方田鼠病原学等级、质量监测及管理。2规范性引用文件GB/T14926.1实验动物沙门菌检测方法GB/T14926.4实验动物皮肤病原真菌检测方法GB/T14926.6实验动物支气管鲍特杆菌检测方法GB/T14926.12实验动物嗜肺巴斯德杆菌检测方法GB/T14926.14实验动物金黄色葡萄球菌检测方法GB/T18448.2实验动物弓形虫检测方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实验东方田鼠laboratoryreedvole学研究以及实验教学的东方田鼠。普通级东方田鼠conventionalreedvole;CVreedvole不携带所规定的人兽共患病病原和东方田鼠烈性传染病病原的东方田鼠。无特定病原体级东方田鼠specificpathogenfreereedvole;SPFreedvole除普通级东方田鼠应排除的病原外，不携带对实验东方田鼠健康有较大危害、主要潜在感染或条件2致病病原以及对科学研究干扰大的病原的东方田鼠。无任何可检出的细菌、病毒和寄生虫等病原的东方田鼠。下列缩略语适用于本文件。PCR:聚合酶链反应(polymerasechainreaction)5东方田鼠病原学等级普通级东方田鼠、无特定病原体级东方田鼠、无菌级东方田鼠病原学具体控制指标见表1。表1实验东方田鼠病原检测项目东方田鼠等级无菌级无特定病原体级普通级沙门菌Salmonellaspp.●皮肤病原真菌PathogenicdermalfungiO●汉坦病毒Hantavirus(HV)●体外寄生虫(节肢动物)Ectoparasites●弓形虫Toroplasmagondii支气管鲍特杆菌BordetellabroncO●●●金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus●仙台病毒SendaiVirus(SV)●小鼠肺炎病毒PneumoniaVirusofMice(PVM)●呼肠孤病毒Ⅲ型ReovirustypeⅢ(Reo-3)●全部蠕虫AllHelminths●卡氏肺孢子虫PneumocystiscariniiO兔脑原虫EncephalitoznoncuniculiO鞭毛虫Flagellates●纤毛虫Cilliates●6.2病原学检测项目东方田鼠病原学检测项目见表1。对受检实验东方田鼠应在当日按细菌、真菌、病毒和寄生虫要求联合取样检测，检测程序见图1。检测报告图1检测程序4表2东方田鼠微生物检测方法病原检测项目沙门菌按照GB/T14926.1实验动物沙门菌检测方法皮肤病原真菌按照GB/T14926.4实验动物皮肤病原真菌检测方法按照GB/T14926.6实验动物支气管鲍特杆菌检测方法嗜肺巴斯德杆菌按照GB/T14926.12实验动物嗜肺金黄色葡萄球菌按照GB/T14926.14实验动物金按照GB/T18448.1实验动物体外寄生虫检测方法弓形虫兔脑原虫按照GB/T18448.3实验动物兔脑原虫检测卡氏肺孢子虫按照GB/T18448.4实验动物卡氏肺孢子虫检测方法按照GB/T18448.6实验动物蠕虫检测按照GB/T18448.10实验动物肠道鞭纤毛虫按照GB/T18448.10实验动物肠道鞭按照附录A实验东方田鼠病原体PCR检测方法按照附录A实验东方田鼠病原体PCR检测方法按照附录A实验东方田鼠病原体PCR检测方法按照附录A实验东方田鼠病原体PCR检测方法按照附录A实验东方田鼠病原体PCR检测方法小鼠肺炎病毒按照附录A实验东方田鼠病原体PCR检测方法呼肠孤病毒Ⅲ型按照附录A实验东方田鼠病原体PCR检测方法按照GB/T14926.41实验动物无菌动物生活环境9监测规则每3个月至少检测一次。9.2.1动物周龄选择8周龄以上实验东方田鼠用于检测。同一实验东方田鼠生产繁殖单元或种群，根据种群规模确定取样数量，具体见表3。5群体数量/只取样数量/只(雌雄各半)不少于10不少于209.3.1采样部位样本采集的部位取决于所检病原体在宿主体内、外的特定定植部位或病变部位：a)对于寄居于呼吸道的病原体，应采集气管分泌物或气管中段；b)定位于肠道的病原体，应采集回盲部内容物或粪便；c)定植于皮肤的病原体，应采集皮肤样品；e)对其他特定定植部位的病原体，应采样方法根据不同的采样部位按下列方法进行：能立即提取核酸的标本，在2℃~8℃条件下保存不应超过24h,超过24h保存的用于提取DNA的样品应置于一20℃以下冰箱，用于提取RN10结果判定6(规范性)实验东方田鼠病原体PCR检测方法核酸抽提试剂：核酸提取试剂盒或其他等效方法。表A.1PCR引物序列、产物长度、扩增部位及扩增条件引物序列P1:5'-AACAGGATTAGATAP2:5'-TGACGGGCGGTGTGTA95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,20个循环P3:5'-GTGCTAGGTGTTGGGP4:5'-TACTTTACGTAGCCTGT95℃变性30s,72℃延伸30s,20个循环P1:5'-AGCGTTTGCTTCACTTTP2:5'-GGGCATTTCCTCCCTAA55℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环P1:5'-AGTGATGAGTCCTTCACATCP2:5'-GGATCCTAGGCATTTGATTG95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环P1:5'-ACGAGGGGCAGCTTGTGATAGP2:5'-GACATCCTCATATGAGCTGTCP1:5'-CCACATTGGTCTCGTGTCAGATTC-3’P2:5'-CATCATTCACGAAATCCTGGAGT呼肠孤P1:5′-CAGTCGACACATTTGTGP2:5'-GCGTACTGACGTGGAT小鼠肺炎病毒P1:5′GGATCTTTCTAGTCCTTCTGP2:5'-CATCTCTAATCAATGCAATCTA.1.2主要仪器7A.2.1采样及标本处理剖检动物，根据不同病原体特定定植部位采集0.2g病变组织、回盲部内容物或粪便，放于无菌离A.2.2样品保存不能立即提取核酸的标本，在2℃~8℃条件下保存不应超过24h,超过24h保存的用于提取A.2.3核酸提取OD260/280比值在1.6～1.8之间为合格。制备A.2.4逆转录(仅限RNA病毒适用)表A.2RNA逆转录反应体系用量/μI2PrimeScriptRTEnzymeMixIRandomPrimer6mers(100μmol4总体积PCR反应体系见表A.3。反应体系的配制应在冰浴上进行，每次反应同时应设阳性对照、阴性对照和空白对照。表A.3PCR反应体系2×TaqPlusMasterMix(Dye8表A.3PCR反应体系(续)118总体积A.2.6反应程序95℃预变性5min;PCR反应条件及循环数见表A.1;72℃延伸10min。取10μLPCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳。阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的目的条带则表明反应体系正常；否则本A.3.2结果判定A.3.3序列测定必要时，取待检样品PCR扩增产物进行核酸序列测定，序列结果与已公开发表的病原体序列进行比对，序