CN115836667B 全身性过表达人源α-Syn-NLS转基因鼠的构建方法 （中国医学科学院医学生物学研究所）

所全身性过表达人源α-Syn-NLS转基因鼠的NLS转基因鼠的构建方法，本发明方法首先通过体pDown_hSNCA/SV40NLS构建入慢病毒载体中，进行病毒包装纯化得到过表达核输入α_Syn的获得全身过表达核输入人源α_Syn蛋白的转基23[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人源α_Syn_NL结果表明在帕金森病(AD)和阿尔兹海默病(PD)患者大脑及氧化应激的细胞中，均发现α_了α_Syn_3*NLS重组腺相关病毒载体，并且通过侧脑室注射该病毒获得全脑过表达核易位聚集引起的胃肠反应或除脑部以外的神经系统的研究，pAAV_IRES_hrGFP_Syn_3*NLS转基[0004]本发明提供了一种全身性过表达人源α_Syn_NLS转基因鼠组表达载体α_Syn_SV40NLS，再经ApaLI+NheI酶切后，以慢病毒LV过表达载体pLV_EGFP:4载体中，进行病毒包装纯化得到过表达核输入α_Syn的pLV病毒(LV_EGFP:T2A:Puro_EF1A>hSNCA/SV40NLS)，采用受精卵原核注射方法注射该病毒，获得全身过表达核输入人源α_[0011]图1为酶切鉴定最终构成的慢病毒载体，图中泳道55为ApaLI+NheI(2066,3985,[0017]使用基于λ噬菌体位点专一重组系统的Gateway技术构建载体(质粒)，Gateway技[0018]主要试剂：Gateway8BPClonaseTMIIEnzymeMix(Invitrogen)，Gateway8LRSanprep柱式胶回收试剂盒(生工)，质粒小提试剂盒(TiANGEN)，TaqDNAPolymerase(Fermentas)，dNTPMix(Fermentas)，GeneRulerTM100bpDNALadder(Fermentas)，VB5[0023]atcgGGTCTCGGGGTTCATACCT[0031]1.2.4PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳参照生工Sanprep柱式胶回收试剂盒说明书进[0032]a.用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5mL离心管[0037]g.在吸附膜中央加入15_40μLElutionBuffer，室温静置1_2min，9000g离心6℃5_10min；7ddHZ0加至10UL[0066]实验相关仪器：洁净工作台SW_CJ_2FD(苏净安泰)；研究级倒置显微镜IX73[0067]试剂：Lipofectamine(Invitrogen)；Opti_MEMI培养液(Invitrogen)；蔗糖[0070]1.2转染前1h换液，加入opti-MEMBI培养液[0072]1.4将孵育后的转染复合8[0080]3.1.1接种HEK293细胞到96孔板，每孔接种100μL细胞悬液(104cels/well)，含℃培养过夜；[0084]通过抗p24包被的微量滴定孔捕获HIV_1p24抗原，并与生物素化的第二抗_p24抗[0090]选择4_10周龄c57bl/6J雌小鼠腹腔内注射5国际单位(IU)的孕马血清促性腺激素(PMSG)，约在48_54h后再将2.5_5.0IU的人绒毛膜促性腺激素(hCG)注射于同一小鼠腹腔