CN115838641B 一种利用乙酰CoA合成酶（ACS）提高产油微生物乙酸盐耐受度和脂质积累的方法 （江南大学）

本发明公开了一种利用乙酰一CoA合成酶(ACS)提高产油微生物乙酸盐耐受度和脂质积累的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明在高山被孢霉中对其内源组成型MaACS进行过表达，提高了重组菌对乙酸盐的耐受度、脂质产量和以花生四烯酸(ARA)为代表的多不饱和脂肪酸(PUFAs)比例，并采用了一种以本发明还利用CRISPR/Cpf1多基因操作系统进一步优化乙酰CoA代谢途径，在过表达所述MaACS的同时组合表达柠檬酸裂解酶(ACL1)进一步强化乙酰CoA供应，或表达葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD2)平衡还原力NADPH的供给避免乙酰一CoA型蛋白激酶复合体SNF1γ亚基提高乙酰24.乙酰CoA合成酶在调节产油微生物合成脂含有权利要求1~3任一所述重组菌株的全细胞催化剂为发酵菌株，在含有乙酸根和铵盐的6.权利要求1~3任一所述重组菌株或权利要求5所述方法在3积累的方法，具体涉及一种乙酰一CoA合成酶及其在生产富含多不饱和脂肪酸油脂中的应[0002]多不饱和脂肪酸(PUFAs)摄入水平是评价膳食质量的重要指标，人体主要通过饮高山被孢霉是目前商业化生产花生四烯酸(ARA)的唯一菌种，相关油脂产品主要作为营养在发酵后期降至4以下，而前期已证实脂肪酸脱饱和及延长过程更适合在pH6以上的环境[0008]ACS广泛存在于原核生物和真核生物中，是脂质和乙酸盐代谢的重要节点。据报4ACS最主要的研究集中于其对肿瘤细胞存活的影响机制：在葡萄糖和氧气供应匮乏的癌细型ACS编码基因Maacs1和Maacs2，二者同源性为85％。生物信息学分析结果显示MaACS1和生物来源的ACS功能鉴定相关研究较少，关于乙酸盐利用和提高脂质积累方面的功能考察[0012]本发明提供一种重组菌株，以高山被孢霉为宿主，过表达氨基酸序列如SEQID[0013]在一种实施方式中，所述重组菌还敲低5[0017]在一种实施方式中，所述pBIG2_ura5s_ITs载体记载于公开号为CN103571762A的[0020]在一种实施方式中，所述重组菌株以高山被孢霉MA_Pcbh1_LbCpf1_ura5_或CCFM201310347934.8专利申请文本中，所述高山被孢霉MA_Pcbh1_LbCpf1_ura5_记载于公开号[0026]在一种实施方式中，所述重组菌株以高山被孢霉MA_Pcbh1_LbCpf1_ura5_或CCFM201310347934.8专利申请文本中，所述高山被孢霉MA_Pcbh1_LbCpf1_ura5_记载于公开号[0036]本发明还提供了上述重组菌株或上述全细胞催化剂或上述方法在脂质生产方面6酰辅酶A羧化酶(ACC1)活性促进脂质积累(SNF1_γ亚基干扰)。通过优化[0048]图1，高山被孢霉Maacs2重组菌(MA_Maacs2)转化子基因组PCR验证结果。M，[0050]图3，高山被孢霉Maacs2重组菌在以乙酸铵为氮源的培养基中不同时间点生长和7[0051]图4，高山被孢霉Maacs2重组菌在以乙酸铵为氮源的培养基中不同时间点目标蛋[0052]图5，利用CRISPR/Cpf1多基因操作系统对高山被孢霉乙酰_CoA代谢途径进行优Masnf4Ri协同过表达时重组菌总生物量和脂[0053]下述实施例中涉及的高山被孢霉(Mortierellaalpina)ATCC32222购自美国标tumefaciens)AGL_1购自北京华越洋生物；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia为CN103571762A的专利申请文本中；下述实施例中涉及的高山被孢霉MA_Pcbh1_LbCpf1_ura5_记载于公开号为CN112592926A的专利申请文本中；下述G6PD2和SNF1γ亚基相序列如SEQIDNO.13所示)和CN110656097A(SNF1γ亚基干扰载体，氨基酸序列如SEQID[0055]下述实施例中涉及的KODplus高保真DNA聚合酶购自日本Toyobo公司；下述实施例中涉及的TaqDNA聚合酶购自CWBIO公司；下述实施例中涉及的反转录试剂盒(PrimeScriptRTregentKitwithgDNAEraserRR047A&R6110A)购自日本Takara公司；接酶、Trizol、PCR产物纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒、GeneRulerDNALadderMix、的DEPC水、卡那霉素(Kanamycin,Kana)、利福平(Rifampicin，Rif)、壮观霉素酸购自上海生物工程有限公司；下述实施例中涉及的酵母提取物、胰蛋白胨购自Oxoid公(Urail)、5_氟尿嘧啶、酵母氮源(YeastNitrogenBase,WITHOUTAminoAcidsCAS#[A610507_0500]Lot:C418BA0040)和各类氨基酸购自生工生物工程(上海)股份有限公司；8[0058]高山被孢霉(Mortierellaalpina)ATCC32222、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)AGL_1以及大肠杆[0063]Kendrick培养基(产脂)中的铵态氮也可选择2.0g/L酒石酸铵替换1.67g/L乙酸[0066]MM诱导敲除培养基(诱导Pcbh1启动子及核酸酶，对尿嘧啶筛选标记进行敲除)：[0067]MM基础培养基：1.74g/L磷酸氢二钾、1.37g/L磷酸二氢钾、0.146g/L氯化钠、9[0077]蛋白提取液：8mol/L尿素，1％(w/w)十二烷基硫酸钠，65mmol/L二硫苏糖醇，[0080]根据乙酰CoA合成酶的EC号(6.2.1.[0081]高山被孢霉中有2个AMP一形成型ACS编码基因Maacs1和Maacs2，二者的同源性为[0082]使用Trizol法提取高山Takara反转录试剂盒说明书进行反转录获得cDNA，在高山被孢霉(Mortierellaalpina)ATCC32222的cDNA文库中通过PCR反应扩增Maacs2，扩增Maacs2所用引应体系为50μL，体系内容按照该DNA聚合酶说明书内容进行；反应过程如下：95℃预变性[0090]使用限制性内切酶HindⅢ和SmaⅠ对实施例1获得的Maacs2的DNA序列以及表达载体pBIG2_ura5s_2myc_ITs进行酶切(pBIG2_ura5s_2myc_ITs是在pBIG2_ura5s_ITs基础上，22[0095]将获得的重组质粒pBIG2_ura5s_2myc_Maacs2通过电击转化法转入根癌农杆菌有CRISPR/Cpf1多基因操作系统的高山被孢霉MA_Pcbh1_LbCpf1_ura5_的孢子。于4℃~281.2，得到携带重组质粒pBIG2_ura5s_2myc_Maacs2的根癌农杆菌菌液；取携带重组质粒pBIG2_ura5s_2myc_Maacs2的根癌农杆菌菌液与高山被孢霉MA_Pcbh1_LbCpf1_ura5_孢子正确的阳性转化子(PCR结果如图1所示)。即获得携带Maacs2基因的重组高山被孢霉MA_[0098]由图1可知，通过使用通用引物进行PCR验证，携带重组质粒pBIG2_ura5s_2myc_Maacs2的根癌农杆菌的T_DNA区域的尿嘧啶回补标记ura5s和目的基因Maacs2可被成功扩增出来，且条带大小符合理论值(因引物设计在载体上，所获得的片段比实际片段大[0099]随机选取重组高山被孢霉MA_Maacs2转化子的单孢子接种于Broth培养基(活化，Maacs2使得重组菌脂质积累得到了不同程度的提高，其中对照组野生型ATCC32222发酵7子脂肪酸含量显著高于对照组野生型ATCC32222(p＜0.05)。其中2号转化子和8号转化子的脂肪酸含量分别达到细胞干重的43.53±0.05％和48.37±0.62上述2个转化子脂肪名为MA_Maacs2_1和MA_Maacs2取步骤(1)筛选到的两株重组菌(2号和8号转化子，图3中分别标注为Ma_Maacs2_1、Ma_[0109]根据高山被孢霉重组菌在以乙酸铵为氮源的Kendrick培养基中不同时间点样品生长和产脂情况分析可看出(图3)，Maacs2氮源的Kendrick培养基(不添加乙酸盐)培养条件仪钟干燥后使用8M尿素溶解，使用BCA法测定蛋白浓度，进行SDS_PAGE和westernblot分孢霉MA_Maacs2中不同时间点目标蛋白表[0114]根据不同时间点重组高山被孢霉MA_Maacs2重组菌中MaACS2蛋白表达水平，可以证遗传改造菌株中目标基因的可用性提供了更加客观的参[0117]上一阶段以高山被孢霉MA_Maacs2为出发菌利用基因编辑技术进行筛选标记ura5[0120]为进一步提高过重组菌脂质积累能力，参考实施例2表达Maacs2的步骤，结合例获得的重组菌分别命名为MA_Cpf1_Maacs2_Maacl1，MA_Cpf1_Maacs2_Mag6pd2和MA_[0121]选择测序正确的重组高山被孢霉MA_Cpf1_Maacs2_Maacl1，MA_Cpf1_Maacs2_CoA和还原力NADPH是脂肪酸合成最基本的二碳单位和辅因子，协同表达Maacs2和g6pd2通过平衡乙酰_CoA和还原力NADPH的供给，提高了重组菌MA_Cpf1_Maacs2_Mag6pd2总生物量[0122]ACL是胞质最主要的乙酰_CoA来源，前期实验发现MaACL1对高山被孢霉脂肪酸积[0123]蔗糖非发酵型激酶复合体是人类AMP激活的蛋白激酶(AMPK)同系物，二者均为异报道证实敲除或敲低SNF1复合体各亚基可通过解除对ACC1的磷酸化作用