CN115867572B 用于增加治疗剂在犬中的半衰期的组合物和使用方法 （因外泰克斯公司）

US2018009869A1,2018.01.112023.03.282023.01.06PCT/US2021/0318262WO2021/231464EN2021.11.18用于增加治疗剂在犬中的半衰期的组合物提供了用于增加一种或多种多肽在犬中的2的氨基酸序列组成的犬IgGFc区的变体5.如权利要求1所述的多肽，其还包含结合结构6.一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)如权利要3[0002]本申请要求2020年5月11日提交的美国临时申请号63/023,083和2020年12月7日[0003]本公开总体上涉及与它们的野生型对应物相比在犬中具有增加的半衰期的多肽与合适的Fc组合以获得期望的半衰期和效应子功能的的不与Fc区或其犬FcRn结合区连接的这些结合分子的版本具有增加的半衰期。还提供了与其野生型对应物相比具有增加的半衰期。除了具有增4[0012]本公开的特征在于重组蛋白，所述重组蛋白包含(1)特异性结合配体或蛋白质表[0014]还公开了包含本文所公开的犬IgGFc区变体和多肽的融GLP_1受体激动剂和犬血小板生成素结合肽的配体结合结构域或细胞外结构域。在一些情所述多肽包含在选自由以下组成的组的位置处的至少一[0020]其中在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的位置处的氨基酸取代选自由Tyr、5[0025]在一些实施方案中，多肽包含与选自由SEQIDNO:9至12组成的组的氨基酸序列6[0053](vii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处的Asp、Tyr、Phe、7[0105]在一些实施方案中，至少一个另外的氨基酸取代位于选自由以下组成的组的位8[0128](xi)在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg、[0129]在一些实施方案中，至少一个另外的氨基酸取代位于选自由以下组成的组的位[0137](iii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置处的A[0138](iv)在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg、[0143](iv)在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg或9[0152](viii)氨基酸位置285处的Asp、氨基酸位置311处的Val和氨基酸位置378处的[0155](xi)氨基酸位置256处的Asp、氨基酸位置285处的Asp、氨基酸位置286处的Asp、[0157](xiii)氨基酸位置307处的Gln、氨基酸位置311处的Val和氨基酸位置378处的基酸位置311处的Val和氨基酸位置37所述多肽在选自由以下组成的组的两个或更多个位置处包置312对应的位置处的氨基酸取代是D312[0201]在一些实施方案中，结合结构域包含(i)免疫球蛋白分子的六个互补决定区[0202]在一些实施方案中，结合结构域特异性结合选自由以下组成的组的抗原：NGF、括向所述狗施用有效量的包含本文所述的药物组合物括向所述狗施用有效量的包含本文所述的药物组合物[0230]图2是犬IgGγ链的CH2区的氨基酸序列比对。这些序列分别被指定为SEQID[0231]图3是犬IgGγ链的CH3区的氨基酸序列比对。这些序列分别被指定为SEQID[0236]图8A_8C描绘了在位置250处来自NNK文库的野生型和不同变体的Biacore传感[0237]图9A_9C描绘了在位置252处来自NNK文库的野生型和不同变体的Biacore传感[0238]图10A和10B描绘了野生型和变体A254T的Biacore传感图。较亮的线代表测量数[0239]图11A和11B描绘了野生型和变体G309P的Biacore传感图。较亮的线代表测量数[0240]图12A和12B描绘了野生型和变体Q311V的Biacore传感图。较亮的线代表测量数[0241]图13A和13B描绘了野生型和变体D378V的Biacore传感图。较亮的线代表测量数[0242]图14A和14B描绘了野生型和变体E380A的Biacore传感图。较亮的线代表测量数[0243]图15A_15F描绘了在位置434处来自NNK文库的野生型和不同变体的Biacore传感[0245]图17A_17B描绘了不同变体的BiacoreNNK文库传感图。所用的犬FcRn的浓度为[0247]图19A_19C显示了IgGA野生型、IgGAA426Y变体和IgGA[0249]图21A_21F显示了结合的Biacore传感图。用于A426H_N434RIgG变体的犬FcRn的浓度为200nM(白色圆圈)、[0250]图22A_22E显示了[0251]图23显示了犬IgGBFc的N434Y变体在pH6.0下与犬FcRn结合的Biacore传感图。用于变体的犬FcRn的浓度为50nM(白色正方形)、100nM(黑色圆圈)、200nM(白色圆圈)、[0255]图27显示了IgGBFc的N434Y变体在pH7.4下与[0257]图29显示了携带单个氨基酸取代或氨基酸取代组合的犬抗神经生长因子(NGF)[0259]图31是使用非线性混合效应建模的具有线性清除率的二房室药代动力学(PK)模[0261]图33显示了携带野生型IgGBFc或IgGB变体A426Y、A426Y+Y436H、A426Y+Y436H+深灰色显示并且突变体结构以浅灰色显示。右侧结构是IgGBFc，其中WT结构以深灰色显称为IgGA、IgGB、IgGC和IgGD。这些重链的氨基酸和DNA序列可从Tang等人,[0277]GPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTIS[0279]GPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKAR(S[0281]GPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQ[0283]GPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTI[0287]KPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHS[0289]QPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPG[0291]QPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTF[0293]QPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSH[0297]VPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMH[0299]APEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHS[0301]GCGLLGGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVVVDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQSNGTYRVVSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSRDEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVD[0303]VPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK(S种对照多肽增加包含这些Fc区的一种或多种多肽在狗中的半衰期的在野生型犬IgGA、[0306]本公开提供了包含犬IgG的Fc结构域或其犬FcRn结合区的多肽，其中所述多肽包[0311]其中在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的位置处的氨基酸取代选自由Tyr、[0316]在一些实施方案中，多肽包含与选自由SEQIDNO:9至12组成的组的氨基酸序列序列。或3个)与野生型犬IgGFcCH2上述区域与野生型犬IgGFcCH2区中[0325]在一些情况下，犬IgGFcCH3区变体中的以下区域中的至少一个(例如，1个或2个)与野生型犬IgGFcCH3区中的相应上述区域与野生型犬IgGFcCH3区中个或5个)与野生型犬IgGFc中的相应个或5个)与野生型犬IgGFc中的相应CH3区变体包含与SEQIDNO:5至8中任一者所示的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少[0348](ii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置426对应的氨基酸位置处的Tyr、His或Phe；中所述多肽与野生型犬IgG的Fc结构域相比与犬F多肽与野生型犬IgG的Fc结构域相比与犬FcRn的结合增加。本公开涵盖的至少一个另外的[0363]在一些情况下，本公开涵盖的至少一个另外的氨基酸取代包括表2中公开的那些[0374](viii)氨基酸位置285处的Asp、氨基酸位置311处的Val和氨基酸位置378处的[0377](xi)氨基酸位置256处的Asp、氨基酸位置285处的Asp、氨基酸位置286处的Asp、氨基酸位置311处的Val和位置378[0379](xiii)氨基酸位置307处的Gln、氨基酸位置311处的Val和氨基酸位置378处的基酸位置311处的Val和氨基酸位置37[0391]在一些实施方案中，至少一个另外的氨基酸取代位于选自由以下组成的组的位[0419](vii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置286对应的氨基酸位置处的Asp、Tyr、Phe、[0473]在一些实施方案中，至少一个另外的氨基酸取代位于选自由以下组成的组的位[0497](xi)在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg、[0499]在一些实施方案中，至少一个另外的氨基酸取代位于选自由以下组成的组的位[0507](iii)在与野生型犬IgG的氨基酸位置256对应的氨基酸位置处的A[0508](iv)在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg、[0513](iv)在与野生型犬IgG的氨基酸位置434对应的氨基酸位置处的Trp、Tyr、Arg或增加或降低效应子功能和/或改善产物异质性的[0522]本文所公开的取代的所有可能组合和排列都由本公开所涵盖。在一些实施方案代中的仅一个的多肽相比时所述多肽对犬FcRn相当的测定是指基本上以相同或相似的方式操作以便最小化或以其他方式避免不必要的用于确定FcRn结合的测定所必需的条件可以不同于在pH7.4下进行类似测定所必需的条置312对应的位置处的氨基酸取代是D312致与另一个氨基酸取代相似的性质或功能的取代。例如，A426Y的保守氨基酸取代可以是[0550]在一些实施方案中，多肽包含与选自由SEQIDNO:9至12组成的组的氨基酸序列序列。或3个)与野生型犬IgGFcCH2上述区域与野生型犬IgGFcCH2区中[0558]在一些情况下，犬IgGFcCH3区变体中的以下区域中的至少一个(例如，1个或2个)与野生型犬IgGFcCH3区中的相应上述区域与野生型犬IgGFcCH3区中个或5个)与野生型犬IgGFc中的相应个或5个)与野生型犬IgGFc中的相应CH3区变体包含与SEQIDNO:5至8中任一者所示的氨基酸序列至少75％、至少80％、至少造和纯化方法的开发。本公开涵盖在Fc区变体的一个或多个另外的氨基酸位置处的取代，亲和力(例如，以增加或降低与FcRn的结合亲和力)。在一些变化中，修饰可以是选自由[0586]在一些实施方案中，Fc区具有LALA突变(EU编号中的L234A和L235A突变)或LALA_PG突变(EU编号中的L234A、L235A、P329G突变)。在一些实施方案中，LALA突变是P234A、互换使用以表示在骆驼科(Camelidae)中发现的那些类型的抗体(其通常天然地发现缺乏情况下，本公开的重组蛋白中使用的铰链区与SEQIDNO:17_21中任一者所示的氨基酸序[0598]非肽接头也可以用于将感兴趣的一种或多种多肽与本文所公开的Fc区变体连2PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、P1GF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原TRANCER)、TNFRSF11B(OPGOCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAKRFN14)、TNFRSF13B(TACTNFRSF1A(TNFR1CD120a、p55_60)、TNFRSF1B(TNFRIICD120b、p75_80)、TNFRSF26TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4_1BBCD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DCTRAILR2TNFSF10(TRAILApo_2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAKApo_3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRILTALL2)、TNFSF13B(BAFFBLYS、TALL1、种多肽与药学上可接受的载体或赋形剂混合。(参见例如，Remington'sPharmaceuticalSciencesandU.S.Pharmacopeia:NationalFormulary,MackPublishingCompany,Gilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,McGraw_Hill,NewYork,N.Y.；Gennaro(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy，Lippincott、Williams和Wilkins,NewYork,N.Y.；Avis等人(编辑)(1993)PharmaceuticalDosageForms:ParenteralMedications,MarcelDekker,NY；Lieberman等人(编辑)(1990)PharmaceuticalDosageForms:Tablets,MarcelDekker,NY；辑)(1990)PharmaceuticalDosageForms:DisperseSystems,MarcelDekker,NY；Weiner和Kotkoskie(2000)ExcipientToxicityandSafety,MarcelDekker,Inc.,New[0606]可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序确定单独施用或与另一种药剂组合施用的多肽组合物的毒性和治疗功效，例如用于确定LD50(使群体的50％致死的剂体的脂质体中，靶向例如关节炎关节或以免疫病理学为特征的病原体诱导的病变)施用一多肽和所治疗疾患的严重程度。选择合适剂量的治疗性抗体的指导是可用的(参见例如，WawrzynczakAntibodyTherapy,BiosScientificPub.Ltd,Oxfordshire,UK(1996)；[0611]本领域技术人员例如使用本领域已知或怀疑影响治疗的参数或因素来确定一种[0614]本文所述的一种或多种多肽可以在细菌或真核细胞中产生。一些多肽(例如Fab端残基)氨基酸序列的情况下再编码基因的核苷酸序列。潜在再编码的区域包括与翻译起HB101或XL1_Blue)用作宿主时，载体必须具有启动子，例如lacZ启动子(Ward等人,341:大肠杆菌中有效表达的T7启动子。此类载体的示例包括例如M13系列载体、pUC系列载体、用氯化钙方法或电穿孔方法将表达载体引入细载体包括在这些细胞中表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等人,Nature,种多肽的示例性哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216_4220中描述的dhfr–CHO细胞，其与例如在CMV增强子/AdMLP启动子调控元件或SV40增强子/AdMLP启动子调控元件)以驱动基因的高[0621]本文所公开的一种或多种多肽可以用于治疗或预防有需要的狗的任何疾病或病(Renilla)、Ptilosarcus或Aequorea物种的GFP(Chalfie等人,1994,Science263:802_QuantumBiotechnologies,Inc.1801deMaisonneuveBlvd.West,8thFloor,Montreal,Quebec,CanadaH3H1J9；Stauber,1998,Biotechniques24:462_471；Heim等人,1996,素酶(Ichiki等人,1993,J.Immunol.150:5408_5417)、β半乳糖苷酶(Nolan等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.[0634]与补体第一组分C1q的结合是抗体介导补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力的量模型(例如Tg32或Tg276转基因小鼠)[0639]丙氨酸扫描诱变(Morrison和Weiss,Curr.Opin.Chem.Biol.5:302_307(2001))在域的野生型(wt)序列并将其用作诱变的模板。使用编码改变的引物通过PCR诱变将除了位振(SPR)分析来自条件培养基的上清液在pH5.5下与犬FcRn(UniProtKB_E2R0L6[FcRn]和UniProtKB_E2RN10[犬β2微球在10mM乙酸钠(pH4.5)中稀释的BSA注射到流动池2中以实现缀合，同时将流动池1设定为空白。在胺偶联反应后，用420s注射1mM乙醇胺盐酸盐阻断芯片表面上剩余的活性偶联位[0646]NNK饱和诱变方法是在期望的位置产生所有20种可能氨基酸的有效策略(Hogrefe与QuikChange定点诱变试剂盒(Agilent)一起使用。使用实施例1中所述的Biacore方法测定中使用的犬FcRn的浓度为200nM而不是400nM。所有NNK文库变体的传感图显示于图8_15[0647]对于在位置250处的NNK文库，没有一个变体显示在pH5.5下与犬FcRn的结合增更高的亲和力。A254T变体的数据显示于表6中，并且人IgG1中的相应变体已用于YTE变体(M252Y/S254T/T256E)，其在pH6.0下对人FcRn具有增加的亲和力(Dall’Acqua等人,J.Immunol.169:5171_5180(2002))并且已经证明在临床前模型中以及在人类中增加人IgG的半衰期(Borrok等人,J.Biol.Chem.290:4282_4290(2015)；Robbie等人,[0656]对于在位置309和311处的NNK文库，没有一个测试变体(L309P和Q311V)与其他变体的几种组合已被证明在pH6.0下对人FcRn具有更高的亲[0661]对于在位置378和380处的NNK文库，没有一个测试长人IgG在转基因人FcRn小鼠中的半衰期(Monnet等人,MABS.6:422_436(2014)；Booth等6.0下对人FcRn具有更高的结合亲和力(Shields等人,J.Biol.Chem.276:6591_6604Deng等人,DrugMetab.Dispos.38:600_605(2010))。在位置434处筛选的NNK文库不含有[0671]进一步评价了在pH5.5下对犬FcRn表现出更高亲和力的几种犬IgGB变体对犬[0675]合成犬IgGB的CH2和CH3结构域的野生型(wt)序列(SEQIDNO:10)并且将其用作NNK诱变的模板。NNK饱和诱变方法是在期望的位置产生所有20种可能氨基酸的有效策略述的传感器芯片表面上。PelB(果胶酸裂合酶B)信号肽位于N末端以促进Fc分泌到培养基于在位置286和436处的变体在pH6.0下使用表面等离子体共振(SPR)分析来自条件培养基的上清液与犬FcRn(UniProtKB_E2R0L6[FcRn]和UniProtKB_E2RN10[犬β2微球蛋白])的结位置286和436处的变体在pH6.0下测定来自每个文库的90个单独转化体的上清液与犬通过新鲜混合的50mmol/LN_羟基琥珀酰亚胺和200mmol/L1_乙基_3_(3_二甲基氨基丙在10mM乙酸钠(pH4.5)中稀释的BSA注射到流动池2中以实现缀合，同时将流动池1设定为空白。在胺偶联反应后，用420s注射1mM乙醇胺盐酸盐阻断芯片表面上剩余的活性偶联位点。用于结合实验的运行缓冲液是HBS_EP(10mMHEPES、500mMNaCl、3mM位置312或426处具有氨基酸取代的变体)和在pH6.0下(对于在位置286或436处具有氨基酸[0685]进一步评价了对犬FcRn表现出更高亲和力的几种犬IgGB变体对犬FcRn的结合动YTE变体(L252Y/A254T/T256E)和野生型犬IgGBFc在pH5.5或pH6.0下和在pH7.4下与犬pH7.4下的Biacore条件，所使用的运行缓冲液是10mMHEPES、500mMNaCl、3mMEDTA、[0692]使用GearingDP等人(2013,BMCVeterinaryResearch,9:226)描述的可变结构域合成在位置426(通过EU编号)携带氨基酸修饰的两种犬Fc变体和野生型犬IgGAFc(SEQIDNO:9)。合成犬IgGADNA并且将其亚克隆到pcDNA3.4载体(ThermoFisher)中并使用ExpiCHO转染方法(ThermoFisher)转染到ExpiCHO_S细胞中。在转染细胞后14天，使用的50mmol/LN_羟基琥珀酰亚胺(NHS)和200mmol/L1_乙基_3_(3_二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)来活化流动池1和2的传感器芯片表面，持续100s(10μL/min)。将抗体在10mmol/LNaAC(pH4.5)中稀释并注射到流动池2中以实现约100个应答单位的缀合，然而剩余的活性偶联位点。用于pH6.0结合实验的运行缓冲液是HBS_EP(10mMHEPES、500mM独的缓冲液注射用作应答单位扣除的参考。下面表17提供了pH6.0结合实验的动力学数比，IgG与BiacoreCM5生物传感器芯片的胺偶联将对FcRn的亲和力降低了2_3倍(Abdiche[0697]使用GearingDP等人(2013,BMCVeterinaryResearch,9:226)描述的可变结构式。合成犬IgGBDNA并且将其亚克隆到pcDNA3.4载体(ThermoFisher)中并使用ExpiCHO转脂(GenScript)纯化条件培养基。使用Biacore8K在pH6.0和pH7.4条件下测量抗体与犬[0698]对于pH6.0结合条件，通过新鲜混合的50mmol/LN_羟基琥珀酰亚胺(NHS)和200mmol/L1_乙基_3_(3_二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)来活化流动池1和2的传IgG和A426H_N434RIgG变体，流过传感器芯片的犬FcRn的浓度为200nM、400nM、800nM、使用Biacore8K评价软件1.1版处[0699]每个循环中的流动池1和单独的缓冲液注射用作应答单位扣除的参考。下面表18列出了pH6.0结合实验的动力学数据。先前已经证明，与通过基于溶液的方法或直接与[0702]对于pH7.4结合条件，通过新鲜混合的50mmol/LN一羟基琥珀酰亚胺(NHS)和200mmol/L1乙基3(3二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)来活化流动池1和2的传反应后，用420s注射1mol/L乙醇胺盐酸盐阻断芯片表面上剩余的活性偶联位点。用于pH成解离持续120秒。流速为30μl/分钟。下面表19列出了pH7.4结合实验的动力学数据。[0706]实施例8：体内筛选与野生型犬IgGBFc相比具有增加的FcRn结合的犬IgGBFc变[0707]用16只雄性和雌性小猎犬进行药代动力学(PK)研究。通过使用GearingDP等人(2013,BMCVeterinaryResearch,9:226；其内容以引用的方式整体并入本文)描述的抗NGF可变结构域将氨基酸取代掺入犬IgGB(SEQIDNO:10)中来制备携带单个氨基酸取代或通过对抗NGF抗体特异的ELISA测定抗体变体的存[0708]每个单独血清抗体测量的非房室PK分析(NCA)使用用于药代动力学分析的已建立pharmacodynamicdataanalysisinMicrosoftExcel”,YongZhang等人,Comput.MethodsProgramsBiomed.；2010年9月；99(3):306_14.doi:10.1016/在至少最后4周的抗体测量中估计终末半衰期以能够稳健估计斜率。在任何实验中没有数改善了抗NGFIgGB抗体在犬体内的终末和野生型)与犬FcRn(UniProtKB_E2R0L6[犬大亚基FcRn]和UniProtKB_E2RN10[犬β2微球蛋BMCVeterinaryResearch,9:226)描述的可变结构域将携带单个氨基酸取代或氨基酸取代组合的犬Fc变体合成为犬IgGB(GENBANK登录号AAL35302.1)形式。将合成的犬IgGBDNA亚克隆到哺乳动物表达载体中并瞬时转染到CHO细胞中。使用蛋白A色谱法纯化条件培养物传感器时相比所述BiacoreCM5生物传感器芯片低估了Fc变体对FcRn的亲和力。在这组范围的犬FcRn并且以单循环模式注射。对每种变体测试的犬FcRn的浓度显示于下面表20注射三次，至少三个仅缓冲液循环用于适当的参考扣除。表面通过两次注射1XPBS_P+(pH变体KD用于拟合数据的方法野生型9.51E_07稳态亲和力A426Y8.78E+05A426Y+T286L4.36E_024.23E_08A426Y+D312P4.97E_024.51E_08A426Y+Y436H6.08E_025.77E_08A426Y+T286L+Y436H5.67E+064.12E_027.26E_09A426HA426H+T286L4.17E_023.58E_08A426H+T286Y2.86E_022.13E_08A426H+D312P5.32E_024.05E_08A426H+Y436H8.08E+05[0721]用雄性和雌性小猎犬完成了三个药代动力学(PK)研究。使用GearingDP等人[0725]使用非线性混合效应建模的具有线性清除率的二房室药代动力学(PK)模型描述了血清浓度(图31)。群体PK参数使用Monol建模为具有对数正态分布的随机变量。从包括所有变体和研究的合并数据估计群体参数。将野生型IgGB变体用作参[0735]为了提供对犬IgGBFc变体与犬FcRn结合的分子机制的见解，使用MOE软件(MolecularOperatingEnvironment(MOE)_,2020.09；ChemicalComputingGroupULC,1010SherbrookeSt.West,Suite#910,Montreal,QC,Canada,H3A2R7,2020)基于在与YTE_Fc结构域(PDBID:4N0U)的复合物中的人FcRn的共晶体结构创建了在与犬FcRn的复合物中的犬IgGBFc的结构模型。在MOE中将突变并入模型的结构中并且用Amber14:EHT力场使能量最小化。使用Pymol软件(ThePyMOLMolecularGraphicsSystem,版本1.2r3pre,schr⃞dinger,LLC)测量犬Fc_FcRn相互作用距离。[0736]具有在低pH下增加对犬FcRn的亲和力的变体的286、426和436的犬Fc位置显示于中性pH下H436上缺乏电荷会驱使相邻残基保留在不利的结合环境中。然而，质子化的His436的更亲水/正电荷性质为残基诸如FcRn大亚基中的E135提供更有吸[0739]犬IgGBT286L变体显示于图38中，并且不直接与FcRn中的犬β2微球蛋白相互作[0740]犬IgGBFc上的A426Y、Y436H和T286L变体的组合已建模(图39)。预测A426Y和Y436H变体之间的空间冲突导致436移动到更有利于结合的位置。这可以与His的pH依赖性体(A426Y、Y436H和T286L)在低pH下与犬FcRn的体外结合数据与三种变体的组合以加合的555MetThrMetThr55555515