DNA重组技术的基本工具

基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论达尔文提出生物进化论基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论摩尔根证明基因在染色体上，并提出基因的连锁交换定律。基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论

艾弗里证明DNA是遗传物质，DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体。基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论沃森、克里克提出DNA的双螺旋构造模型。基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保存复制基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论克里克等提出中心法则DNARNA蛋白质转录翻译逆转录复制基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路后期基础理论

1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA体现实验的成功6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种能够合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中体现，可哺育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。

想一想需要做哪些核心工作？苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉基因工程哺育抗虫棉的简要过程：在以上过程中核心环节或难点是什么？普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因通过运载体导入转基因棉花含抗虫基因转基因棉花产生伴胞晶体转基因棉花有抗虫特性一、DNA重组技术的基本工具基因工程哺育抗虫棉的核心环节：核心环节一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来核心环节二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”核心环节三：抗虫基因进入棉花细胞一、DNA重组技术的基本工具解决哺育抗虫棉的核心环节需要哪些工具？“分子手术刀”——限制性核酸内切酶关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1.1、DNA重组技术的基本工具如何切割DNA分子呢？DNA分子磷酸二酯键切割DNA分子实质是断开两个核苷酸之间的磷酸二酯键。一、限制性核酸内切酶—“分子手术刀”限制酶的识别序列：中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback

EcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback重复演示什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。SmaⅠ平末端平末端要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会如何呢？会产生相似的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎能够合成重组的DNA分子了。思考?Goback……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段连接起来生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……酶切二、“分子缝合针”——DNA连接酶①作用:把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.②作用原理：催化磷酸二酯键形成可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶或T4DNA连接酶即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶③类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功效大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相似点差别（二）“分子缝合针”——DNA连接酶DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点寻根问底DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板Goon三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体⒈载体需要的条件：⑴有1~多个限制酶切点⑵对受体细胞无害⑶导入基因能在受体细胞中复制、体现⑷有某些标记基因，便于筛选⒉惯用运载体：⑴细菌的质粒⑵噬菌体或某些动植物病毒⑶如果目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？⑴作为分子运输车——载体，如果没有切割位点将会如何？⑵霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？⑷目的基因有无进入受体细胞，如何去发现？

最惯用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对受体细胞生存没有决定性作用，但复制只能在受体细胞内完毕。质粒是一种裸露的、构造简朴、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并且含有自我复制能力的双链环状DNA分子。质粒是基因工程最惯用的载体。惯用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄