CN116375847B 酵母重组xvii型人源化胶原蛋白及其制备方法 （江苏创健医疗科技股份有限公司）

CGMCCNo.218882021.03.11CGMCCNo.218842021.03.11CGMCCNo.218902021.03.11CGMCCNo.218892021.03.11酵母重组XVII型人源化胶原蛋白及其制备本发明提供了一种酵母重组XVII型人源化白具有达到乃至超过天然人胶原的细胞粘附活2GenPept.UniProtKB/Swiss-GenPept.UniProtKB/Swiss-DestabilizedbyaGCol15.THEJOURNALOFBI页.DestabilizedbyaGCol15.THEJOURNALOFBI页.GenPept.UniProtKB/Swiss-3国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.21889、CGMCC所述重组XVII型人源化胶原蛋白为表达XVII型胶原蛋白第15螺旋区的重组人源化胶2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，4[0002]人有28种不同的胶原蛋白，其中人XVII胶原蛋白是一种跨膜型非成纤维胶原蛋X_Y)n氨基酸重复序列及能否形成三螺旋区域分为16个非三螺旋区和15个三螺旋区。其中第15螺旋区是人XVII胶原蛋白中最有应用潜力的往被毕赤酵母中的蛋白酶系统降解，特别是于高密度发酵表达天然序列的重组蛋白质时5稳定性是重组人胶原蛋白生产开发中(以现有科学水平不可认知到的)隐患最少的一种策酸序列(专利中命名为17A)和另一段63个氨基酸序列(专利中命名为17B)及以这两段序列[0009]在某些实施方式中，所述重组XVII型人源化胶原蛋白包括与SEQIDNO.2XVII型胶原蛋白第15螺旋区生物学活性的氨基酸序6[0023]本发明还提供了一种提高重组XVII型人源化胶原蛋白生产水平且蛋白低降解的或者包括SEQIDNO.2所示的氨基2O[0033]在某些实施方式中，所述步骤(3)中诱导培养基组分包括：纯甲醇、50％甘油、7所述纯化包括依次进行的疏水层析和阳离子2PO42PO4[0037](1)疏水层析：配制缓冲液A：20mMKH2PO4，2M硫酸铵，pH5.0；缓冲液B：20mMKH2PO42PO4者包括SEQIDNO.2所示的氨基酸序[0041](1)本发明首次实现了天然XVII型胶原蛋白第15螺旋区(命名1703NT，序列如SEQ螺旋区序列1703NT进行了少数氨基酸残基的突变，命名1703MNT(序列如SEQIDNO.6所[0043]本发明的人XVII胶原蛋白的第15螺旋区应用于人体不会产生免疫排斥和过敏反DNA序列。本发明对1703NT、1703MNT的DNA序列进行修饰，分别于二者氨基端添加编码8[0045](3)本发明基于高密度规模化发酵生产需求(而非实验室研究阶段)建立了天然全化胶原蛋白1703巴斯德毕赤酵母(Pichiapasto巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)工程菌株(保藏编号CGMCCNo.21889)能达到>15g/L。件起到了抑制重组胶原蛋白降解的作用，其效果与1703M这样改变氨基酸序列的突变体带[0049](3)本发明通过实验验证了重组表达的第15螺旋区的生物学活性，本发明得到的9[0054]图3为1703诱导表达24h后的菌液上清SDS_PAGE检测结果中目的条带质谱分析结[0055]图4为1703M诱导表达24h后的菌液上清SDS_PAGE检测结果中目的条带质谱分析结及过程没有多作说明的都是本领域技术人员根据产品说明书或本领域基础知识可以理解[0084]GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGPPGSGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGPDGHQGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPGLTGPQGPQGL[0085]编码1703NT的DNA序列以毕赤酵母为宿主进行密码子优化，优化后的序列如SEQ[0086]GGTTCTCCTGGTCCAAAAGGAGATATGGGTTCACCCGGTCCCAAAGGAGATAGAGGATTCCCTGGTACTCCAGGTATCCCCGGTCCCCTGGGTCACCCTGGACCTCAAGGTCCTAAAGGTCAAAAGGGTTCTGTAGGAGATCCAGGTATGGAGGGTCCCATGGGTCAGAGAGGTAGAGAAGGTCCCATGGGACCAAGAGGTGAAGCTGGACCTCCCGGAAGTGGTGAAAAAGGAGAAAGAGGAGCAGCAGGAGAACCTGGACCCCATGGACCTCCAGGAGTTCCTGGATCAGTCGGACCCAAAGGTTCATCCGGTTCTCCTGGACCTCAAGGTCCACCAGGACCCGTCGGATTGCAAGGATTGAGAGGAGAAGTTGGACTTCCCGGAGTTAAGGGTGACAAGGGTCCTATGGGTCCTCCTGGTCCAAAGGGAGATCAGGGTGAAAAGGGTCCTAGAGGTCTGACTGGTGAACCAGGAATGAGAGGACTTCCCGGTGCCGTGGGTGAACCCGGTGCAAAAGGAGCAATGGGTCCTGCCGGTCCTGATGGACACCAGGGACCCAGAGGAGAGCAGGGATTAACAGGAATGCCTGGTATCAGAGGTCCCCCAGGTCCCTCAGGAGACCCAGGAAAGCCAGGACTTACTGGTCCCCAGGGTCCTCAAGGTCTGCCTGGAACTCCCGGAAGACCCGGAATCAAAGGTGAACCAGGAGCCCCAGGAAA[0088]YVEFWSHPQFEKGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPMGPRGEAGPPGSGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPRGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGPDGHQGPRGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPGLTGPQGPQGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKI[0092]GSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPPGPPGEAGPPGSGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGPDGHQGPPGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPGLTGPQGPQGL[0094]GGTTCTCCAGGTCCTAAAGGAGATATGGGTTCTCCAGGACCAAAGGGAGATAGAGGTTTTCCAGGTACTCCTGGTATTCCAGGTCCTTTGGGTCATCCAGGTCCTCAAGGTCCAAAGGGTCAAAAAGGTTCTGTTGGAGATCCAGGAATGGAAGGTCCAATGGGTCAAAGAGGTAGAGAAGGTCCACCTGGTCCACCTGGAGAAGCTGGTCCACCTGGTTCTGGTGAAAAGGGAGAGAGAGGTGCTGCTGGAGAGCCAGGTCCTCACGGTCCACCTGGTGTTCCTGGTTCTGTTGGTCCAAAAGGTTCTTCTGGTTCTCCAGGACCACAAGGTCCACCTGGTCCAGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCAGGTGTTAAGGGAGATAAAGGTCCTATGGGTCCACCTGGTCCAAAGGGAGATCAAGGTGAAAAAGGTCCACCTGGTTTGACTGGAGAGCCTGGTATGAGAGGTTTGCCAGGTGCTGTTGGTGAACCTGGTGCTAAGGGTGCTATGGGTCCAGCTGGTCCTGATGGTCATCAAGGTCCACCTGGAGAGCAAGGTTTGACTGGTATGCCAGGTATTAGAGGTCCACCTGGACCTTCTGGAGATCCAGGTAAACCTGGTTTGACTGGTCCACAAGGTCCTCAAGGTTTGCCAGGTACTCCTGGTAGACCAGGTATTAAGGGAGAGCCTGGTGCTCCAGGT[0096]YVEFWSHPQFEKGSPGPKGDMGSPGPKGDRGFPGTPGIPGPLGHPGPQGPKGQKGSVGDPGMEGPMGQRGREGPPGPPGEAGPPGSGEKGERGAAGEPGPHGPPGVPGSVGPKGSSGSPGPQGPPGPVGLQGLRGEVGLPGVKGDKGPMGPPGPKGDQGEKGPPGLTGEPGMRGLPGAVGEPGAKGAMGPAGPDGHQGPPGEQGLTGMPGIRGPPGPSGDPGKPGLTGPQGPQGLPGTPGRPGIKGEPGAPGKI[0098]TACGTAGaattcTGGTCACATCCACAATTTGAGAAGGGTTCTCCAGGTCCTAAAGGAGATATGGGTTCTCCAGGACCAAAGGGAGATAGAGGTTTTCCAGGTACTCCTGGTATTCCAGGTCCTTTGGGTCATCCAGGTCCTCAAGGTCCAAAGGGTCAAAAAGGTTCTGTTGGAGATCCAGGAATGGAAGGTCCAATGGGTCAAAGAGGTAGAGAAGGTCCACCTGGTCCACCTGGAGAAGCTGGTCCACCTGGTTCTGGTGAAAAGGGAGAGAGAGGTGCTGCTGGAGAGCCAGGTCCTCACGGTCCACCTGGTGTTCCTGGTTCTGTTGGTCCAAAAGGTTCTTCTGGTTCTCCAGGACCACAAGGTCCACCTGGTCCAGTTGGTTTGCAAGGTTTGAGAGGTGAAGTTGGTTTGCCAGGTGTTAAGGGAGATAAAGGTCCTATGGGTCCACCTGGTCCAAAGGGAGATCAAGGTGAAAAAGGTCCACCTGGTTTGACTGGAGAGCCTGGTATGAGAGGTTTGCCAGGTGCTGTTGGTGAACCTGGTGCTAAGGGTGCTATGGGTCCAGCTGGTCCTGATGGTCATCAAGGTCCACCTGGAGAGCAAGGTTTGACTGGTATGCCAGGTATTAGAGGTCCACCTGGACCTTCTGGAGATCCAGGTAAACCTGGTTTGACTGGTCCACAAGGTCCTCAAGGTTTGCCAGGTACTCCTGGTAGACCAGGTATTAAGGGAGAGCCTGGTGCTCCAGGTAAAAT[0100]以发明人已授权的专利CN113185604B中表达载体pPIC9K_col17a1为模板设计引酶切回收的目的片段和质粒以3:1分子量混合，使用Takara公司的DNALigationKit进行[0103]cgGAATTCTGGAGTC[0105]ATAGTTTAGCGGC得表达质粒pPIC9K_1703NT和pPIC9K_17[0111]将线性化质粒电转化入空宿主菌种毕赤酵母GS115(购自中国工业微生物菌种保[0112]向MD平板表面加入2mL无菌双蒸水，然后用无菌三角涂布器轻轻刮下平板表面的His+转化子，并转移到50mL离心管中。以无菌双蒸水稀释菌悬液，105个细胞涂布于含有[0113]构建的4种工程菌样本均送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保[0120]分别挑选单菌落，置于装有10mLBMGY培养基的100mL三角瓶中，于28_30℃、股份有限公司)进行WesternBlot检[0123](2)1703M降解条带明显少于1703、1703MNT降解条带明显少于1703NT，1703、[0124]从图2(ECL化学发光显色，全自动化学发光图像分析系统Tanon5200将蛋白质分[0125]图1和图2可以看出，修改氨基酸序列后的变体1703M更稳定，蛋白降解得到了缓HPLC_MS/MS质谱检测重组胶原的胰蛋白酶解后肽段(交由苏州普泰生物技术有限公司完酶解后检测到的肽段均属于氨基酸序列选取设计时选择人XVII胶原蛋白序列的相关区域，2O基础盐制备的发酵培养基。菌株为表达蛋白1703的巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)工2OPTM1发酵培养基的5L发酵罐(保兴生物)中，调节搅拌转速为300r/min_700r/min，空气通量为子量较大的为全长条带(占比40％左右)分子量比较表达重组胶原蛋白1703巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)工程菌株，保藏编号为CGMCC[0149]1#～4#发酵罐发酵过程均控制基本一致：将菌种接于种子培养基YPG中，30℃、按10％接种量加到含有3L发酵培养基D(1#～4#发酵罐中培养基pH值不同)的5L发酵罐(保加12mLPTM1；(4)发酵培养基，发酵母培养基D：NH4H2PO411.9g/L、KH2PO42.515g/L、CaSO4定OD600定OD600密度最大)只有一条，1#发酵罐发酵诱导初始OD600＝50蛋白表达量明显高于OD600＝100和[0165]1#～4#发酵罐发酵过程均控制基本一致：将菌种接于种子培养基YPG中，30℃、CaSO4[0175]按以上发酵条件，使用表达蛋白1703巴斯德毕赤酵母工程菌株(保藏编号CGMCC16.316.217.2[0178]同时，同样的发酵工艺，也可应用于表达蛋白1703NT巴斯德毕赤酵母(Pichia[0179]经过一系列发酵工艺优化，表达蛋白1703巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)工程菌株(保藏编号CGMCCNo.21888)在5L罐中胶原蛋白表达量从11g/L左右提高到17g/L左右，表达蛋白1703NT的巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)工程菌株(保藏编号CGMCC且电导率保持在192ms/cm左右，在流速不变的情况下，缓冲液B进行洗杂(0.45μm滤膜过冰箱中待用。FastFlow，装载于思拓凡生物工程科技有限公司，AKTApure150M)至A215吸光值降到[0190]取1703、1703NT冻干品用超纯水溶解至2mg/mL，均0.22μm滤膜过滤，进样10μL[0196]蛋白1703的理论预测的分子量为24968.16Da、蛋白1703NT的理论预测的分子量FisherScientificUltimate3000、电喷雾_四极杆飞行时间质谱仪质谱仪ABSCIEXTripleTOF5600MassSpectrometer，色谱柱ACQUITYUPLCProteinBEHC4Column)获取证[0198]N端测序通过岛津全自动蛋白质多肽测序仪(PPSQ_33A)对样品的N端序列进行分Pro_Glu_Phe_Glu_Lys_Gly_Ser_Pro，即YVEFWSHPQFEKGSP，与理论N_端氨基酸序列PGTPGRPGIKGEPGAPGKIHHHHHH，与理论C_端氨基酸序列(PGTPGRPGIKGEPGAPGKIHHHHHH)一行胰蛋白酶(Trypsin)、糜蛋白酶(Chymotrypsin)、胃蛋白酶(Pepsin)、胰蛋白酶酸序列及其总覆盖率均为100样本蛋白的氨基酸序列与理内扫描(ThermoScientific，NicoletTMiSTM10FT_IR光谱仪)，方法及结果分析参照(Jeong,H.,J.VenkatesanandS.Kim,Isolationandcharacterizationofcollagenfrommarinefish(Thunnusobesus).BiotechnologyandBioprocessEngineering,2013.18(6):p.1185_1191.)图17、18、19、20)可以看到其其特征吸收均波数均符合重组胶原蛋白结构特征：酰胺A外光谱研究.材料导报,2008(03):第119_121页.[2].Doyle,B.B.,E.G.BenditandE.R.Blout,Infraredspectroscopyofcollagenandcollagen_likepolypeptides.Biopolymers,1975.14(5):p.937_957.[3].周爱梅等,重组人源胶原蛋白的[0206]重组胶原蛋白的细胞黏附活检测方法参考文献JumingYao,SatoshiYanagisawa,TetsuoAsakura.Design,ExpressionandCharacterizationofCollagen_LikeProteinsBasedontheCellAdhesiveandCrosslinkingSequencesDerivedfromNativeCollagens,JBiochem.136,643_649(2004)。委托常州大学药学院