海洋微生物多样性和其研究方法专业知识专家讲座

浩瀚海洋是地球上生命摇篮，它覆盖地球表面积70.8%。从海面到海底深层蕴藏着数量惊人生物、能源、矿产以及空间资源。当前研究表明，海洋微生物不但在海洋生态环境和物质循环中含有极其主要作用，也是各种新型生物活性物质潜在起源。 因为世界面临严重资源、环境、人口问题，海洋生物资源包含海洋微生物资源开发与多样性研究已成为各沿海国家关注热点。第1页 19，Issatchenko出版第一本海洋微生物研究专著《北冰洋细菌研究》，确定了海洋微生物学研究方向，并使海洋微生物学发展成为独立学科。第2页

Certes,A.1884.Ontheculture,freefromknownsourcesofcontamination,fromwatersandfromsedimentsbroughtbackbytheexpeditionsoftheTravailleurandtheTalisman:1882-1883.C.R.Hebd.SéancesAcad.Sci.,98:690-693第3页ZoBell,C.E.1946.MarineMicrobiology.ChronicaBotanica,Waltham,MA.Johnson,T.W.etal.1961.FungiinOceansandEstuaries(海湾）.WeinheimpublishedbyJ.CramerWood,E.J.F.1965.MarineMicrobialEcology.Chapman&HallpressWood,E.J.F.1967.MicrobiologyofOceansandEstuaries.ElsevierPublishing,LondonColwell,R.R.,etal.1974.EffectoftheOceanEnvironmentonMicrobialActivities.UniversityParkPress,Baltimore.Colwell,R.R.,etal.1975.MarineandEstuarineMicrobiologyLaboratoryManual.UniversityParkPress,BaltimoreWood,E.J.F.1975.Thelivingocean:Marinemicrobiology.CroomHelmLitchfield,C.D.1976.MarineMicrobiology.Dowden,utchingon&RossInc.第4页Sieburth,J.McN.1979.SeaMicrobes.OxfordUniversityPressVincent,W.F.1988.MicrobialEcosystemsofAntarctica.CambridgeUniversitypress,NewYorkAustin,B.1988.MarineMicrobiology.CambridgeUniversityPressBartlett,D.H..MolecularMarineMicrobiology.HorizonScientificpressKirchman,D.L..MicrobialEcologyoftheOceans.Wiley_LisspressPaul,J.H..MarineMicrobiology(MethodsinMicrobiolgy,volume30)AcademicPressSmithJ..MicrobiologyofMarine&FreshwaterEnvironments.Chapman&HallMunn,C.B..MarineMicrobiology:EcologyandApplication.BIOSScientificPublishers第5页Hobbie,J.E.1984.HeterotrophicActivityintheSea(NATOconferenceseries)PlenumPubCorpVreeland,R.H.1991.MicrobiologyofDeep-SeaHydrothermalVents（热水口）

(MicrobiologyofExtremeandUnusualEnvironments).CRCPressKarl,D.M.1995TheMicrobiologyofDeep-SeaHydrothermalVents(CrcSeriesonMicrobiologyofExtremeandUnusualEnvironments).CrcPrILlc

。。。。。。第6页薛廷耀编.海洋细菌学.科学出版社.1962北京克里斯

AE.著.孙国玉，李世珍译.海洋微生物学（深海）.科学出版社.1964北京

林永成，周世宁主编.海洋微生物及其代谢产物.化学工业出版社.北京第7页海洋细菌多样性第8页摘自MartinkoJM.,etal.1997,BrockBiologyofMicroorganisms（中译本）生物系统发育第9页摘自MartinkoJM.,etal.1997,BrockBiologyofMicroorganisms（中译本）细菌系统发育第10页微生物种类多样性第11页Whatismarinebacteria?第12页关于物种概念

物种是一个能够相互交配繁殖自然群体，并与其它群体在生殖上是隔离（Mayr,1969）； 物种是一个含有本身进化趋向和历史结局祖裔群体单一谱系，并维持其特征与其它类似谱系不一样（Wiley,1978）；

微生物种是一群含有高度表型相同菌株集合体，该菌株集合与其它类群菌株存在显著差异（Stanier,1986）；第13页

species,unitsofevolutionandecology,shouldbeconsideredasecologicallyunique(e.g.differentbiotypes,virulence（至病）

properties,habitats,hostranges)

----from:WardD.M.,Anaturalspeciesconceptforprokaryotes.CurrOpinMicrobiol1998,1:271-277第14页Majorhorizontalzonationinanoceanprofile.(Soruce:Odum1971.)Intertidal:潮间带neritic浅海区euphoticzone透光层Aphoticzone无光层Continentalshelf大陆架Continentalslope大陆斜坡Continentalrise大陆隆hadalzone深海带(6000米以下)abyssalplain深海平原trench沟第15页Principalenvironmentalcharacteristicsofanestuary.HWOST=highwaterlineofspringtide;LWOST=lowwaterlineofspringtide.第16页ThermalVentCommunities第17页Marinebacteriashouldexhibitgrowthatsalinitiesbetween20-40partsperthousand.Truemarinebacteriawillnotgrowintheabsenceofsodiumchloride.Marinebacteriamustbecapableofgrowthatthelownutrientconcentrationsfoundintheoceans.Marinebacteriamustbecapableofgrowthatlowtemperatures. 第18页海洋细菌种类多样性及其分布第19页古菌（ARCHAEA）嗜泉古菌界（Crenarchaeota）广域古菌界（Euryarchaeota）初生古菌界（Korarchaeota）

第20页真细菌（EUBACTERIA）变形细菌（Proteobacteria）-α、γ、β、δ、ε-subclass蓝细菌（Cyanobacteria）革兰氏阳性细菌（Gram-positivebacteria）噬纤维菌属-黄杆菌属（Cytophaga-Flavobacterium）浮霉状菌（Planctomycetales）疣微菌（Verrucomicrobiales）螺旋体（Spirochaeta）绿色非硫细菌（Greennon-sulfurbacteria）第21页海洋环境中发觉部分Proteobacteria类群细菌第22页

海洋环境中发觉部分革兰氏阳性细菌第23页海洋细菌基因资源多样性第24页

当前已克隆来自海洋细菌基因第25页海洋细菌特征

及其对多样性研究影响第26页海洋细菌培养特征1附着性和集结性2生长迟缓3特殊培养要求4存在活不可培养状态（viable-but-nonculturable）第27页海洋细菌形态和生理生化特征1海洋微生物细胞形态多变性2生理生化反应多变性3不易传代和保留4难以分类判定第28页

各种生态环境中可培养微生物占该生境微生物总数百分比第29页

要判断海洋环境中分离微生物是海洋生物十分困难。尽管大部分在大海发觉细菌与非海洋细菌有区分，但长久以来，却没有一个确定标准用于区分海洋与非海洋细菌，也没有对海洋细菌做出明确定义。第30页海洋细菌多样性

研究方法及其进展第31页Beijerinck,M.W.(1889):Howmayonerecoversamplesofwaterorsedimentfromthedesiredlocationandknowthatthesamplesareuncontaminatedbytheoverlyingwater?Howdoesoneculturethesemysteriouscreatures?Whataretheirrequirementsforgrowth?Willtheyevengrowinthelaboratoryatall?Whatkindsofmicroorganismsarethere?Dotheyfitintotheclassicaltaxonomicschemes?第32页取样方法1海水样品采集微生物采水器、错流过滤设备2海洋沉积物采集底栖生物采泥器、shinkai6500、Kaiko第33页

依赖微生物分离培养研究方法不依赖微生物分离培养研究方法海洋细菌多样性研究方法第34页依赖微生物培养研究方法1海洋细菌分离培养2海洋细菌分类判定第35页特定海洋细菌类群分离方法第36页古菌、细菌和真核生物

核糖体小亚基RNA基因序列同源性（%）第37页16SrRNA基因（16SrDNA）特点1存在于全部生物细胞中，含有相同结构和功效2含有分子计时器特点，分子序列改变迟缓3基因中存在进化速率不一样结构区域，交替分布，互不影响，可用于亲缘关系远近不一样生物之间系统学研究第38页

16SrRNA基因（16SrDNA）结构模式图经过比较不一样微生物16SrDNA序列之间差异，可能发觉某种生物类群相关特征性核苷酸序列或突变，这些特征性核苷酸序列，为各种微生物资源判定、分类建立起一个简单而统一标准。第39页大肠杆菌rDNA小亚基二级结构模式图第40页不依赖微生物分离培养研究方法显微镜直接检验法脂肪酸分析基因序列分析探针杂交分析第41页脂肪酸分析脂肪酸指纹图谱是细菌分类和判定中十分有用技术，尤其是磷脂酸（phospholipidester-linkerfattyacid，PLFA），不一样类群细菌含有特征性磷脂酸组成，它们易于从土壤、沉积物等环境样品微生物细胞中抽提出来，所以可用于评定自然环境包含海洋环境中活微生物生物量或微生物种群结构.Gruntzigv.,etal.,1985FEMSMicrobiolEcol.31:147-158第42页基因序列分析扩增性rDNA限制性酶切片段多态性分析（ARDRA）末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）变性（或温度）梯度凝胶电泳（DGGEorTGGE）rDNA间隔区分析（RISA）荧光原位杂交技术（FISH）rRNA点/狭线印迹杂交（rRNAdot/slotblot)海洋细菌多样性研究中惯用基因分析技术第43页基于核糖体RNA基因序列分析流程第44页基因序列分析

因为核糖体RNA基因（rDNA）含有高度保守性，在全部细胞生物中都存在，且序列不受环境影响，从而成为迄今为止在细菌多样性研究中应用最多核基因。

基本研究步骤：（1）环境样品中总DNA提取和纯化；（2）rDNAPCR扩增；（3）扩增产物克隆；（4）克隆产物序列测定；（5）序列比较分析和系统学研究。StahlD.A.,etal.1985ApplEnvironMicrobiol.49:1379-1384第45页海洋沉积物中DNA提取方法之比较第46页扩增性rDNA限制性酶切片段多态性分析(AmplifiedRibosomalDNARestrictionAnalysis，ARDRA)

将16SrDNA-PCR技术与RFLP技术相结合而发展起来微生物多样性研究技术；即采取识别4个碱基限制性内切酶对克隆取得16SrDNA进行酶切，经过电泳分析酶切后片段长度多态性。

Rooney-VaraJ.N.,etal.1998SystApplMicrobiol.21:557-568第47页末端限制性片段长度多态性(TermanalRestrictionFragmentLengthPolymorphism，T-RFLP)

利用一定标识引物对样品中DNA进行特异扩增，然后进行限制性内切酶酶切，检测末端限制性片段多态性。

MoesenderM.M.,etal.1999ApplEnvironMicrobiol.65:3518-3525第48页变性梯度凝胶电泳技术(DenaturingGradientGelElectrophoresis,DGGE)

使用一对特异性引物PCR扩增环境样品中16SrRNA基因，产生长度相同但序列不一样DNA片段混合物，该混合物在含梯度浓度变性剂（变性剂浓度由低到高）聚丙烯酰胺凝胶中电泳，在一定温度下，同一变性剂浓度下，序列不一样产物，其解链温度和程度不一样，造成电泳迁移率不一样，从而将不一样序列（只要有一个碱基差异）DNA分开。

BenllochS.,etal.EnvironMicrobiol.4(6):349-360第49页第50页rDNA间隔区分析(rDNAinternalspaceranalysis，RISA)

利用16SrDNA3’保守区和23SrDNA5’保守区设计引物，PCR扩增环境样品中16S-23rDNA间隔区，经过分析该扩增片段核苷酸序列或比较其差异，进行微生物多样性研究。

García-MartínezJ.etal.1999JMicrobiolMethod36:55-64第51页16S–23srDNA间隔区示意图第52页荧光原位杂交(FluorescenceinsituHybridization,FISH)

将荧光标识含有属种（或类群）特异性寡核苷酸探针与经固定环境样品中DNA或RNA进行杂交，并经过扫描共聚焦显微镜（scanningconfocallasermicroscopy，SCLM）检测杂交信号。该技术广泛应用于环境中特定微生物种群判定、种群数量分析及特异微生物跟踪检测。

RavenschlagK.,etal.ApplEnvironMicrobiol66:3592-3602

第53页用于海洋细菌多样性分析探针1基于不一样域、科、属、种乃至亚种核糖体RNA基因（rDNA）设计特异性探针2针对海洋特有细菌类群设计寡核苷酸探针3针对一些特殊生理类群细菌核糖体RNA或功效基因设计寡核苷酸探针第54页海洋特有细菌类群16SrDNA探针第55页基因芯片技术在海洋细菌多样性分析中应用第56页Eilersetal.（）：对德国北海浮游细菌研究表明，培养取得两个优势细菌类群（Roseobacter和Cytophaga-Flavobacterium）中，前者在16SrDNA克隆文库中找到了相关序列，而后者没有；Websteretal.（）：从海绵共生体中取得16SrDNA克隆文库中，没有序列与分离培养取得共生细菌16SrDNA序列相同；Acinasetal.（1999）：海水浮游细菌16SrDNA克隆文库中优势类群SAR86cluster，当前没有在任何可培养细菌中发觉；……study（）：南沙沉积物16SrDNA克隆文库中，没有序列与分离培养取得细菌16SrDNA序列相同第57页新技术======>新发现第58页SAR11GiovannoniSJ.,etal.1990GeneticdiversityinSargassoSeabacterioplankton.Nature345(6270):60-63BritschgiTB.,GiovannoniSJ.1991PhylogeneticanalysisofanaturalmarinebacterioplanktonpopulationbyrRNAgenecloningandsequencing.ApplEnvironMicrobiol57(6):1707-1713FieldKG.,etal.1997Diversityanddepth-spcecificdistributionofSAR11clusterrRNAgenesfrommarineplanktonicbacteria.ApplEnvironMicrobiol63(1):63-70ConnonSA.,GiovannoniSJ.High-throughputmethodsforculturingmicroorganismsinvery-low-nutrientmediayielddiversenewmarineisolates.ApplEnvironMicrobiol68(8):3878-3885RappeMS.,etal.CultivationoftheubiquitousSAR11marinebacterioplanktonclade.Nature418(6898):630-633MorrisRM.,etal.SAR11cladedominatesoceansurfacebacterioplanktoncommunities.Nature420(6917):806-81