CN119023958B 基于多价适配体和cha扩增的比色-荧光双信号检测沙门氏菌的方法 （宁波大学）

基于多价适配体和CHA扩增的比色-荧光双本发明公开了基于多价适配体和CHA扩增的比色_荧光双信号检测沙门氏菌的方法，特点是菌适配体和cDNA混合制备得到多价适配体竞争分别溶解在PBS缓冲液的步骤；将待测沙门氏菌溶液与多价适配体竞争性探针混合，孵育1小时后，加入发夹探针H1和发夹探针H2进行CHA扩增2所述的单链S1的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示：5'_TCGATGACCCACTCTCACTTACACTTCCTACAGTCTGAAACATCTACAGCTCTGCTACACGAGAGATGCACGCACATAGTA_3'；所述的单链S2的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示：5'_TCGATGACCCACTCTCACTTTATCACCAGGTCAGTCTGACAGTGTAGCAGAGCTGTAGATAGATGCTGAGGAGTCCAATAC_3'；所述的单链S3的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示：5'_TCGATGACCCACTCTCACTTTCAGACTGACCTGGTGATAAAACGACACTGACGTGGTGAATCTACTATGTGCGTGCATCTC_3'；所述的单链S4的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示：5'_TCGATGACCCACTCTCACTTTTCAGACTGTAGGAAGTGTGCTTCACCACGTCAGTGTCGTTTGTATTGGACTCCTCAGCAT_3'；所述的沙门氏菌适配体的核苷酸序列为SEQIDNO.5所示：5'_GTGAGAGTGGGTCATCGAAAAAACTCCTCTGACTGTAACCACGGTGGTTTGATCACTATTGGGCCTTTCTGATGTCGGTAGT_3'；针H1的核苷酸序列为SEQIDNO.7所示：5'_FAM_ACCGTGGTTACAGTGGGTGGGTGGGGTCGACTGTAGTGGGTGGGTCGAACCACCGTGGTTACAGTCGACCCCACCCACCCACTGT_3'；取待测样品加入步骤1制备得到的多价适配体竞争性探针溶液中，在室温下孵育1小在步骤3得到的CHA反应产物中继续加入0.1mM的血红素溶液、50mM的H2O2溶液和502.根据权利要求1所述的基于多价适配体和CHA扩增的比色_荧光双信号检测沙门氏菌为95℃加热4分钟并迅速降温至4℃保持1分钟。3.根据权利要求1所述的基于多价适配体和CHA扩增的比色_荧光双信号检测沙门氏菌的H2O2溶液和所述的ABTS2_溶液的体积比为200:20:2.5:2.5:0.96:1.2:3[0003]适配体是一段通过体外筛选技术得到的寡核苷酸序列或短的多肽，通常是由[0006]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于多价适配体和CHA扩增4CACCAGGTCAGTCTGACAGTGTAGCAGAGCTGTAGATAGATGCTGAGGAGTCCAATAC_3'；AGACTGACCTGGTGATAAAACGACACTGACGTGGTGAATCTACTATGTGCGTGCATCTC_3'；CAGACTGTAGGAAGTGTGCTTCACCACGTCAGTGTCGTTTGTATTGGACTCCTCAGCAT_3'；CGAAAAAACTCCTCTGACTGTAACCACGGTGGTTTGATCACTATTGGGCCTTTCTGATGTCGGTAGT_3'；夹探针H1的核苷酸序列为SEQIDNO.7所示：5'_FAM_ACCGTGGTTACAGTGGGTGGGTGG5'_TGGGTGGGTGGGTGGGTCGAACCACCGTGGTTACAGTCGACCCCACCCACCCACTGT_3'；[0020]进一步，步骤1和步骤2中所述的退火处理过程为95℃加热4分钟并迅速降温至4℃保持1分钟。积比为200:20:2.5:2.5:0.96:1.2:5[0024]1、本发明中的多价适配体竞争性探针是一种通过一步法合成的刚性平面纳米结[0028]图2为具体实施例二中多价适配体竞争性探针的琼脂糖凝胶电泳图，其中1为[0033]图7为具体实施例五中基于多价适配体和CHA扩增的荧光法检测沙门氏菌的特异[0034]图8为具体实施例五中基于多价适配体和CHA扩增的比色光法检测沙门氏菌的特[0035]图9为具体实施例六中基于多价适配体和CHA扩增的双信号检测沙门氏菌方法的6μM的沙门氏菌适配体溶液和4μL10μM的cDNA溶液混合于10.4μLTM缓冲液（50mM溶液，其中退火处理过程为95℃加热4分钟并迅速降温至4℃TACAGTCTGAAACATCTACAGCTCTGCTACACGAGAGATGCACGCACATAGTA_3'（划线部分为与适配体[0043]单链S2的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示：5'_TCGATGACCGTCAGTCTGACAGTGTAGCAGAGCTGTAGATAGATGCTGAGGAGTCCAATAC_3'（划线部分为与适配体互[0044]单链S3的核苷酸序列为SEQIDNO.3所示：5'_TCGATGACCCACCTGGTGATAAAACGACACTGACGTGGTGAATCTACTATGTGCGTGCATCTC_3'（划线部分为与适配体互[0045]单链S4的核苷酸序列为SEQIDNO.4所示：5'_TCGATGACCTAGGAAGTGTGCTTCACCACGTCAGTGTCGTTTGTATTGGACTCCTCAGCAT_3'（划线部分为与适配体互进行退火处理（在95℃下变性10分钟，然后在4小时内逐渐冷却至室温得到浓度为1μMGTGGGTGGGGTCGACTGTAACCACGGTGGTT_BHQ_3'，发夹探针H2的核苷酸序列为SEQIDNO.8所7ABTS2[0055]为了直观表征基于多价适配体竞争性探针的形成，将3μL沙门氏菌适配体溶液这表明多价适配体竞争性探针的成功形成。8萄球菌（S.aureus)、106CFU/mL单增李斯特菌(L.monocytogenes)、106CFU/mL大肠杆菌萄球菌（S.aureus)、106CFU/mL单增李斯特菌(L.monocytogenes)、106CFU/mL大肠杆菌[0076]具体实施例六：具体实施例一方法中荧光信号与比色信号之间的线性相关性分9系列不同浓度的沙门氏菌样品，依次为102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL、其在食品检测等应用中的有效性提供了强有力