SCT 7029-2025 水产养殖动物源弧菌耐药性调查规范标准立项发展报告

水产养殖动物源弧菌耐药性调查规范标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:SpecificationforAntimicrobialResistanceSurveillanceofVibriofromAquacultureAnimals摘要随着水产养殖业的集约化与高密度发展，抗菌药物的广泛使用导致水产养殖动物源弧菌的耐药性问题日益突出，不仅严重制约产业健康可持续发展，更通过食物链、水环境及基因水平转移等多重途径对公共卫生安全构成潜在威胁。目前，我国在水产养殖动物源弧菌耐药性调查领域尚缺乏统一的调查方法、判定标准和质量控制规范，各研究机构和检测单位在采样方案、药敏试验方法、结果判定和质量控制等方面操作不一，导致调查数据在区域间和时序上可比性差，难以支撑全国耐药性监测网络的构建及耐药风险管理政策的科学制定。为填补该领域标准空白，全国水产标准化技术委员会组织制定了《水产养殖动物源弧菌耐药性调查规范》（SC/T7029-2025）。本标准规定了水产养殖动物源弧菌耐药性调查的采样方案、菌株分离与鉴定、抗菌药物敏感性试验方法、结果判定标准以及质量控制要求，适用于水产养殖动物体内及养殖环境中弧菌耐药性的系统调查与监测。本标准的发布实施将有效统一全国水产养殖源弧菌耐药性调查的技术要求，为建立规范化、标准化的耐药性监测体系和数据共享机制提供有力技术支撑，对保障水产品质量安全、推动水产养殖业绿色发展及应对细菌耐药性全球性挑战具有重要的基础性意义。关键词：水产养殖；弧菌；耐药性调查；抗菌药物敏感性试验；标准化；监测AbstractWiththeintensiveandhigh-densitydevelopmentofaquaculture,thewidespreaduseofantimicrobialagentshasledtoincreasinglyprominentantimicrobialresistance(AMR)issuesinVibriofromaquacultureanimals.Thisnotonlyseverelyconstrainsthehealthyandsustainabledevelopmentoftheindustry,butalsoposespotentialthreatstopublichealthsecuritythroughmultiplepathwaysincludingthefoodchain,aquaticenvironments,andhorizontalgenetransfer.Currently,Chinalacksunifiedinvestigationmethods,interpretationcriteria,andqualitycontrolstandardsforAMRsurveillanceofaquaculture-derivedVibrio,resultinginpoorcomparabilityofsurveillancedataacrossregionsandtimeperiods,whichimpedestheconstructionofanationalAMRmonitoringnetworkandthescientificformulationofresistanceriskmanagementpolicies.Tofillthisstandardgap,theNationalTechnicalCommitteeforAquacultureStandardizationorganizedthedevelopmentofthe"SpecificationforAntimicrobialResistanceSurveillanceofVibriofromAquacultureAnimals"(SC/T7029-2025).Thisstandardspecifiesthesamplingprotocols,strainisolationandidentification,antimicrobialsusceptibilitytestingmethods,resultinterpretationcriteria,andqualitycontrolrequirementsforAMRsurveillanceofVibriofromaquacultureanimalsandaquacultureenvironments.ThepublicationandimplementationofthisstandardwilleffectivelyunifythetechnicalrequirementsforAMRsurveillanceofaquaculture-derivedVibrioacrossthecountry,providingrobusttechnicalsupportforestablishingastandardizedandnormalizedAMRmonitoringsystemanddatasharingmechanism.Itholdsfundamentalsignificanceforsafeguardingaquaticproductqualityandsafety,promotingthegreendevelopmentofaquaculture,andaddressingtheglobalchallengeofantimicrobialresistance.Keywords:aquaculture;Vibrio;antimicrobialresistancesurveillance;antimicrobialsusceptibilitytesting;standardization;monitoring一、引言1.1研究背景弧菌（*Vibrio*）是一类广泛分布于海水、半咸水及淡水环境中的革兰氏阴性条件致病菌，其中副溶血性弧菌（*Vibrioparahaemolyticus*）、溶藻弧菌（*Vibrioalginolyticus*）、哈维氏弧菌（*Vibrioharveyi*）、创伤弧菌（*Vibriovulnificus*）和鳗弧菌（*Vibrioanguillarum*）等是水产养殖动物的重要病原菌，可引起鱼、虾、贝类等的大规模爆发性死亡，造成重大经济损失。同时，部分弧菌种如副溶血性弧菌和创伤弧菌也是重要的人畜共患病原，可通过食用受污染水产品引起人类食物中毒和创伤感染。近年来，随着抗菌药物在水产养殖中的大量使用甚至滥用，水产养殖动物源弧菌的耐药性呈现快速上升和多重耐药日益加剧的趋势。国内外研究均表明，水产养殖环境中弧菌对四环素类、磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类等多种抗菌药物的耐药率显著升高，且耐药基因可通过质粒、整合子、转座子等可移动遗传元件在不同菌种间传播扩散，形成耐药性传播的"储库"效应，对养殖动物和人类健康均构成严重威胁。1.2标准制定的必要性世界卫生组织（WHO）已将抗菌药物耐药性列为21世纪全球公共卫生面临的十大威胁之一，并发布了"同一健康"（OneHealth）框架下的耐药性应对行动计划。我国农业农村部于2021年印发《全国兽用抗菌药使用减量化行动方案（2021—2025年）》，明确要求加强兽用抗菌药耐药性监测，建立健全动物源细菌耐药性监测网络。然而，在水产养殖动物源弧菌耐药性调查领域，由于缺乏全国统一的技术标准，各监测单位在调查设计、试验方法和结果判定等方面存在显著差异，导致监测数据的系统性和可比性不足。具体而言，国内外虽有临床和实验室标准协会（CLSI）及欧盟药敏试验标准委员会（EUCAST）发布的相关药敏试验标准，但主要针对人源和陆生动物源细菌；水产养殖动物源弧菌在培养条件、药敏试验培养基选择、孵育温度及判定折点等方面均存在特殊性，需制定适合水产弧菌特点的专业标准。此外，现行相关标准如GB/T37625-2019《水产养殖动植物常见病原微生物监测规程》等对弧菌耐药性调查的规定较为笼统，缺乏针对药敏试验方法和结果判定的具体操作规范。因此，制定《水产养殖动物源弧菌耐药性调查规范》十分必要且紧迫。1.3标准编制原则本标准的编制遵循以下原则：一是科学性，充分参考国内外药敏试验标准化规程和最新研究成果，确保检测方法的科学可靠；二是适用性，紧密结合我国水产养殖生产实际和实验室条件，兼顾方法的可操作性和推广性；三是协调性，与CLSI、EUCAST等国际通行标准及国内现行相关标准保持衔接和协调；四是规范性，严格按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的要求进行编制。二、标准主要内容2.1适用范围本标准规定了水产养殖动物源弧菌耐药性调查的基本要求、采样方案、菌株分离与鉴定、抗菌药物敏感性试验、结果判定与记录、质量控制以及调查报告编制等技术要求。适用于鱼类、甲壳类、贝类等水产养殖动物及其养殖环境中弧菌耐药性的调查和监测工作。2.2规范性引用文件本标准主要引用了以下规范性文件：GB19489《实验室生物安全通用要求》、GB/T37625-2019《水产养殖动植物常见病原微生物监测规程》、SC/T7014-2006《水生动物检疫实验技术规范》等，以及CLSIVET04《水生动物抗菌药物敏感性试验方法》和CLSIVET03等国际参考方法。2.3术语和定义本标准对以下关键术语进行了规范定义：耐药性（antimicrobialresistance，即菌株在体外试验中对超过折点浓度的抗菌药物表现出的耐受能力）、多重耐药（指同时对三类或三类以上抗菌药物耐药）、最小抑菌浓度（MinimumInhibitoryConcentration,MIC，即在特定培养条件下能够抑制微生物可见生长的最低药物浓度）、纸片扩散法（Kirby-Bauer法，即将含定量抗菌药物的纸片贴于已接种供试菌的琼脂平板表面以测定抑菌圈直径的方法）以及调查单元、养殖场点等调查设计相关概念。2.4缩略语本标准涉及的主要缩略语包括：AMR（AntimicrobialResistance，抗菌药物耐药性）、MIC（MinimumInhibitoryConcentration，最小抑菌浓度）、MDR（Multi-DrugResistance，多重耐药）、CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute，临床和实验室标准协会）、ATCC（AmericanTypeCultureCollection，美国典型培养物保藏中心）等。2.5调查设计2.5.1调查目的与类型根据调查目的不同，将弧菌耐药性调查划分为基线调查（baselinesurvey）、常规监测（routinesurveillance）和专项调查（targetedinvestigation）三种类型。基线调查旨在获取特定区域或养殖模式下弧菌耐药性的本质水平；常规监测旨在持续跟踪耐药性的时空动态变化趋势；专项调查则针对耐药性暴发事件或特定耐药问题进行深入溯源。调查类型不同，采样方案和样本数量要求也有所差异。2.5.2调查单元与采样点设置调查单元可以为一个养殖场、一个养殖区域或一个行政区域。调查单元的划分应综合考虑养殖模式（池塘养殖、工厂化养殖、网箱养殖、滩涂养殖等）、养殖品种、地理分布及用药历史等因素。采样点的设置应兼顾代表性和随机性，涵盖不同养殖环境（如进水口、养殖池、排水口等）和不同养殖阶段。2.5.3样本量要求样本量应根据预期耐药率、可接受的误差范围及置信水平确定。在一般情况下，每个调查单元采集的样本量应不少于30份，以确保耐药率估计的精度。多重耐药等重点关注指标建议加大样本量。本标准给出了样本量估算的参考公式和常见情形下的最低样本量推荐值。2.6采样方案2.6.1采样对象采样对象包括水产养殖动物（鱼、虾、蟹、贝等）的肝脏、肾脏、肠道、肌肉等组织，以及养殖水体、底泥、饲料等环境样品。对于活体采样，应尽量减少对动物的损伤；对于剖检采样，应严格执行无菌操作。2.6.2采样方法动物组织样品：采用无菌解剖方法，取适量组织（一般不少于1g或1mL）置于无菌采样袋或采样管中。水体样品：使用无菌采水器采集表层及底层水样各不少于500mL。底泥样品：使用无菌采样器采集表层底泥不少于50g。所有样品应编号登记，记录采样时间、地点、养殖品种、采样部位、用药情况等关键信息。2.6.3样品保存与运输采集的样品应尽快（原则上不超过4h）送检。如需短期保存，动物组织样品应置于4℃冷藏保存不超过24h；水体样品应在4℃条件下保存并在12h内处理；底泥样品可于4℃保存不超过48h。长途运输时应采用保温箱加冰袋维持低温条件，并做好防泄漏和标识管理。2.7菌株分离与鉴定2.7.1增菌与分离培养依据样品类型选择合适的增菌培养基和培养条件。动物组织样品可选用碱性蛋白胨水（APW）进行增菌培养，培养温度35℃±1℃，培养时间6~8h；水体样品可取适量（如100mL）经薄膜过滤法浓缩后置于APW中增菌。随后划线接种于硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂平板（TCBS）或其他选择性培养基，于35℃±1℃培养18~24h，观察菌落形态和颜色。典型弧菌菌落在TCBS平板上呈现特征性颜色（如副溶血性弧菌呈绿色、溶藻弧菌呈黄色）。2.7.2纯化与初步鉴定挑取典型单菌落划线接种于营养琼脂或胰蛋白胨大豆琼脂（TSA，补充1%~2%NaCl）平板进行纯化培养。通过革兰氏染色（应为革兰氏阴性杆菌）、氧化酶试验（应为阳性）、运动性观察及O/129（2,4-二氨基-6,7-二异丙基蝶啶）敏感试验等生化试验进行属水平的初步鉴定。2.7.3种的鉴定种水平的鉴定可采用生化鉴定试剂条（如API20E）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）或分子生物学方法（如16SrRNA基因测序、*pyrH*基因、*rpoD*基因或*gyrB*基因序列分析等）。必要时可采用多位点序列分析（MLST）或全基因组测序（WGS）进行更为精细的分类鉴定和耐药基因分析。所有鉴定为弧菌属的菌株均应纯化后于-80℃甘油肉汤中保存，以备后续药敏试验和质量控制使用。2.8抗菌药物敏感性试验2.8.1试验方法本标准推荐采用两种药敏试验方法：肉汤微量稀释法（BrothMicrodilutionMethod）：采用含2%NaCl的阳离子调节Mueller-Hinton肉汤（CAMHB），在96孔微量稀释板中进行。该方法可定量测定MIC值，是推荐的首选参考方法，适用于需要精确定量耐药水平的研究。纸片扩散法（Kirby-BauerDiscDiffusionMethod）：使用含2%NaCl的Mueller-Hinton琼脂（MHA）平板。该方法操作简便、成本低，适用于大批量菌株的耐药性筛查。两种方法均应使用标准化的菌悬液制备方法（0.5麦氏浊度标准）和标准的接种程序。如实验室条件允许，建议同时使用E-test法对关键菌株和重点药物进行MIC验证。2.8.2抗菌药物的选择本标准推荐的抗菌药物面板分为必测药物和选测药物两类。必测药物包括：氨苄西林（AMP）、头孢噻肟（CTX）、头孢他啶（CAZ）、四环素（TET）、强力霉素（DOX）、氟苯尼考（FFC）、恩诺沙星（ENR）、环丙沙星（CIP）、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶（SXT）、庆大霉素（GEN）、阿米卡星（AMK）等。选测药物包括：阿莫西林/克拉维酸（AMC）、头孢吡肟（FEP）、美罗培南（MEM）、多黏菌素E（COL）、替加环素（TGC）、红霉素（ERY）、利福平（RIF）等。所选药物应覆盖我国水产养殖中常用抗菌药物的主要类别，同时兼顾公共卫生关注的重要抗菌药物。2.8.3试验条件肉汤微量稀释法和纸片扩散法的培养温度均为35℃±1℃，培养时间为18~24h（部分生长缓慢菌株可延长至48h）。培养基中添加NaCl的终浓度应统一为2%（W/V），以模拟弧菌生长的最适盐度条件。2.8.4质量控制每次药敏试验应设置标准质控菌株，包括但不限于：大肠埃希菌（*Escherichiacoli*）ATCC25922、铜绿假单胞菌（*Pseudomonasaeruginosa*）ATCC27853和金黄色葡萄球菌（*Staphylococcusaureus*）ATCC29213。海氏弧菌（*Vibrioharveyi*）ATCC14126可作为弧菌属的辅助质控菌株。质控菌株的MIC值或抑菌圈直径应在可接受范围内，否则该批次试验结果视为无效，需重新检测。2.9结果判定2.9.1判定标准耐药性判定标准应优先采用CLSIVET03/VET04文件中针对水生动物细菌的折点标准。对于尚无水产源弧菌特异性折点的抗菌药物，可参考CLSIM45（条件致病菌药敏试验方法）中弧菌属的折点，或参照CLSIM100中肠杆菌目细菌的折点标准，但应在结果报告中注明所采用的折点来源。对于完全没有参考折点的药物，可采用流行病学临界值（ECOFF）进行判定，将MIC分布中的野生型菌株判定为敏感（野生型，WT），非野生型菌株判定为获得性耐药（非野生型，NWT）。2.9.2耐药率计算单一药物的耐药率=（耐药菌株数/受试菌株总数）×100%。按菌种分别统计各调查单元的耐药率，并计算95%置信区间。多重耐药（MDR）定义为对三类（含）以上抗菌药物同时耐药，多重耐药菌株检