CN119120645B 生牛乳中A2β-酪蛋白特征肽的检测方法及检测系统 （东北农业大学）

司生牛乳中A2β-酪蛋白特征肽的检测方法及牛乳中A2β酪蛋白特征肽的检测方法及检测系降解监控数据进行采集，获取实际酶解反应时2(1_1)获取初始底物浓度和初始胰蛋白酶浓度，并从酶解反应数据库中提取预设的参的初始底物浓度对应的酶解反应速率影响因子，⑴2表示预设的胰蛋白酶浓度对应的酶解(1_2)将酶解反应匹配指数与酶解反应数据库中预设的各酶解反应匹配指数区间进行(2_2)将酶解反应进程偏差影响评估值与酶解反应数据库中存储的各酶解反应进程偏3(3_3)将预计酶解反应时间和酶解反应补偿时间进行求和运算，并将求和结果标记为(3_5)将酶解反应参照指标与酶解反应数据库中存储的各酶解反应参照指标区间对应解过度评估指数对应的酶解反应终止判定影响从酶解反应数据库中获取酶解反应终止判定指标阈值，将酶解反应终酶解反应时间预估模块，用于获取初始底物浓度和初始胰蛋白酶浓度，酶解反应时间补偿模块，用于对酶解反应条件数据进行监测，获取反应酶解反应效果评估模块，用于对酶解反应的酶促转化概况数据进行监45[0002]牛乳以其全面的营养成分被誉为自然界的完美食品，牛乳的蛋白质以酪蛋白为6[0012]将酶解反应匹配指数与酶解反应数据库中预设的各酶解反应匹配指数区间进行[0014]将酶解反应进程偏差影响评估值与酶解反应数据库中存储的各酶解反应进程偏[0021]将酶解反应参照指标与酶解反应数据库中存储的各酶解反应参照指标区间对应7[0031](2)本发明通过综合分析初始底物浓度和初始胰蛋白酶浓度，可以对酶解反应时免等待时间过长或过短导致的资源浪费。同时预计酶解时间有助于控制酶解反应的程度，[0032](3)本发明通过对反应环境温度和反应环境pH值进行综合分析，可以及时发现并[0033](4)本发明通过对底物浓度和预期产物浓度进行监测分析，可以及时了解酶解反[0034]利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限[0037]图3为本发明实施例涉及的酶解过度评估指数与酶解反应终止判定指标的函数关8示预设的初始底物浓度对应的酶解反应速率影响因子，⑴2表示预设的胰蛋白酶浓度对应因子的取值范围为[0,+∞)，通过酶解反应历史数据中初始底物浓度和胰蛋白酶浓度与酶对应的酶解反应速率影响因子和胰蛋白酶浓度对应的酶解反应速率影响9[0055]将酶解反应匹配指数与酶解反应数据库中预设的各酶解反应匹配指数区间进行际反应条件与预设参照反应条件的偏离程度，为酶解反应需求时间的修正提供数据依据。解反应速率影响因子和环境温度对应的酶解反应速率影响[0067]将酶解反应进程偏差影响评估值与酶解反应数据库中存储的各酶解反应进程偏[0076]应理解的是，本实施例中酶解不足评估指数用于量化评估酶解反应的不充分程[0086]应理解的是，本实施例中酶解过度评估指数用于量化评估酶解反应的过度程应的酶解过度评估影响因子和溶液酸价对应的酶解过度评估影响[0090]将酶解反应参照指标与酶解反应数据库中存储的各酶解反应参照指标区间对应酶解反应参照指标区间对应的酶解不足评估指数和酶解过度评估指数对应的酶解反应终影响因子和酶解过度评估指数对应的酶解反应终止判定影响酶解反应终止判定指标的函数关系如曲线c所示。本实施例中酶解反应终止判定指标用于定指标阈值进行比对，若酶解反应终止判定指标大于或等于酶解反应终止判定指标阈值，NIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMG试剂盒包括氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的特[0112](4)A2β酪蛋白特征肽含量计算：将步骤(2)得到的峰面积代入步骤(3)获得的标[0115]步骤(1)中的胰蛋白酶酶解过程是利用胰蛋白酶专一作用于精氨酸(R)和赖氨酸[0118]进一步地限定，步骤(2)所述高效液相色谱的检测条件为：硅烷基C18柱，柱长本发明进行进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方SigmaAldrich公司；碘乙酰胺(IAA)、二硫苏糖醇(DTT)、尿素、碳酸氢铵、甲酸均购自Aladdin公司；C18脱盐柱(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)、超滤管(赛多利斯公司，德蛋白特征肽氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：IHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPP[0143]分别取步骤(2)中获得的6个不同系列浓度的特征肽标准曲线工作液100μL至2mL心15min，获得沉淀，然后向超滤管中加入300μL缓冲液(8M尿素溶于100mMTris一HCl，pH8.5)，14000×g条件离心15min，获得沉淀此步骤重复管中加入500μL1mg/mL胰蛋白酶溶液，37℃消化过夜；最后加入10μL10％甲酸溶液终止消[0145]利用高效液相色谱一质谱联用技术对步骤(3)获得的6个不同系列浓度的特征肽[0149]由步骤(4)获得不同系列浓度的特征肽标准曲线工作液待测样品对应的峰面积，[0150]进行线性考察，得到关于A2β一酪蛋白特征肽的线性方程，其线性方程是Y=[0152]取一定量生牛乳样品1以5000rpm的条件进行离心脱脂，取脱脂后的奶样100μL至境下保持30min进行烷基化；将样品加入到超滤管中(10kDa)，并以14000×g条件离心管中加入500μL1mg/mL胰蛋白酶溶液，37℃消化过夜；最后加入10μL10％甲酸溶液终止消[0154]利用高效液相色谱一质谱联用技术对步骤(5)获得的待测样品进行检测，获得峰后在56℃孵育还原30min，冷却至室温后，向离心管中添加100μL碘代乙酰胺IAA(终浓度60mM)，在室温黑暗环境下保持30min进行烷基化14000×g条件离心15min，获得沉淀，然后向超滤管中加入300μL缓冲液(8M尿素溶于[0163]利用高效液相色谱一质谱联用技术对步骤(1)获得的待测样品进行检测，获得峰[0165]将步骤(2)得到的峰面积代入实施例1中步骤(4)获得的标准曲线特征方程，得到心15min，获得沉淀，然后向超滤管中加入300μL缓冲液(8M尿素溶于100mMTris一HCl，pH8.5)，14000×g条件离心15min，获得沉淀此步骤重复管中加入500μL1mg/mL胰蛋白酶溶液，37℃消化过夜；最后加入10μL10％甲酸溶液终止消[0174]