（正式版）DB34∕T 1433-2011 《抗虫和耐除草剂玉米Bt11及其衍生品种实时荧光PCR检测方法》

ICS65.020.20抗虫和耐除草剂玉米Bt11及其衍生品种2011-06-11实施2011-06-11实施IDB34/T1433—2011本标准主要起草人：汪秀峰、杨剑波、马卉、李莉、张士胜、陆徐忠、倪大虎、宋丰顺、杨亚春、倪金龙、陈萍、张毅。DB34/T1433—20111抗虫和耐除草剂玉米Bt11及其衍生品种实时荧光PCR检测方法本标准规定了转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt11的实时荧光PCR转化体特异性检测方法。本标准适用于转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt11及其衍生品种，以及相关制品中Bt11成分的实时下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。3术语和定义Bt11转化体特异性序列event-specificsequenceofBt11外源插入载体5’端与玉米基因组的连接区序列，包括外源载体部分序列和玉米基因组部分序列。通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量的分析。阈值threshold2DB34/T1433—2011是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。Ct值cyclethreshold链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。根据玉米内标准基因zSSIIb和Bt11转化体特异性序列，分别设计引物和探针进行PCR扩增，建立玉米内标准基因zSSIIb和Bt11转化体实时荧光PCR检测方法，根据检测结果判断试样中是否含有转基因成分Bt11。5试剂与材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。5.1琼脂糖。5.270%乙醇(V/V)。中，配成10mg/mL的浓度，于100℃加热15min,缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。5.410mol/LNaOH溶液：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠(NaOH),溶解后再加水定容到2005.5500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0):称取乙二铵四乙酸二钠(EDTA-Na2)18.6g,加入70mL水中，再加入10mol/LNaOH溶液，加热溶解后，冷却至室温，再用10mol/LNaOH溶液调pH至8.0,加水定容到100mL,在103.4kPa(121℃)灭菌20min。5.7dNTPs混合溶液：将浓度为10mmol/L的dATP,dCTP,dGTP,dTTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混5.9引物和探针：序列信息应按附录A执行。用TE缓冲液(5.6)或重蒸馏水将上述引物和探针稀释到10μmol/L储存备用。DB34/T1433—201136仪器6.1分析天平：感量0.1g和0.1mg。紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范围是2μg/mL～50μg/mL。当提取的的比值在1.7～2.0时，满足PCR检测要求。7.5对照设置在PCR反应的同时，应设置阴性对照和空白对照。按农业部869号公告-3-2007规定的执行。当PCR反应体系正常工作时，试样中扩增出内标准基因zSSIIb,说明试样提取的DNA满足PCR则初步判断样品中含有转化体Bt11,应通过实时荧光PCR进一不含有转化体Bt11。实时荧光PCR体系反应体系和反应条件参照附录B和附录C执行。反应体系和反应条件应根据试剂要求进行适当调整。每个反应体系设置3个平行。7.7.2质控标准4在扩增内标准基因zSSIIb时，空白对照荧光曲线平直，阴性对照和阳性对照出现典型的扩增曲线，或空白对照荧光值低于阴性对照和阳性对照荧光值的15%,表明反应体系正常工作；在扩增检测转化体Bt11时，空白对照和阴性对照的荧光曲线平直，阳性对照出现典型的扩增曲线，且检测Ct值≤36或空白对照和阴性对照的荧光值低于阳性对照荧光值的15%,表明反应体系正常工作。否则，表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。a)试样中内标准基因检测Ct值≤36,转化体Bt11检测Ct值≥40,则表明该试样中不含转基因b)试样中内标准基因检测Ct值≤36,转化体Bt11检测Ct值≤36,则表明该试样中含有转基因c)试样中转化体Bt11检测Ct值在36～40,则需调整模板浓度，重新检测。经重复检测后，当检测体系正常时，转化体Bt11检测Ct值<40,则表明该试样中含有转基因成分Bt11,表述为“样品中检测出抗虫和耐除草剂玉米Bt11,检测结果为阳性”;否则，表明该试样中不含转9防污染措施5(规范性附录)实时荧光PCR检测引物和探针序列信息表A.1被检测基因引物或探针序列扩增长度/bpzSSIIb-F:5′-CGGTGGATGzSSIIb-R:5′-AAAGGGCCAGGTzSSIIb-P:5′-FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCBt11-F:5′-GTGTGGAATTGTGAGCGGATAAC-3'Bt11-R:5′-CCGAGGAGGTTTCCCGATATTAC-3'Bt11-P:5′-FAM-AAAGTCTCAATAGCCCTCTGGTCTTCTGACGAG-BHQ1-DB34/T1433—20116(规范性附录)实时荧光PCR检测反应体系表B.1终浓度水2×TaqManMix25mg/LDNA模板2mg/L总体积注1:如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积无菌水。注2:玉米内标准基因PCR检测反应体系中，上下游引物和