核磁共振波谱学方法在分子生物学中的应用课件

核磁共振技术发展史概述1946年E.M.Purcell和F.Bloch发现核磁共振(NMR)现象1965年前后脉冲傅里叶变换NMR技术兴起1971年J.Jeener提出二维NMR

方法80年代中K.Wuthrich发展了运用同核二维核磁共振方法进行蛋白质NMR谱图的序列识别方法80年代末遗传工程技术迅速发展，13C

和15N同位素标记样品大量制备，A.Bax等人提出异核二维核磁共振方法90年代初三维和四维异核核磁共振方法迅速发展，750MHz(1993年)

和800MHz(1995年)高场核磁共振波谱仪问世现在

900MHz核磁共振波谱仪已大量使用，并已可确定分子量大于3.6KDa的蛋白质溶液三维结构一、

NMR简介核磁共振方法简介核磁共振是在二十世纪四十年代被发现的一种物理现象。在六十年的科学技术发展历程内，核磁共振方法在生物学、化学、物理学、药学、医学以及化学工业、食品工业、医药工业等方面显示了极大的生命力，成为研究分析各种物质及其性能的重要边缘学科。NMR方法的研究特点在运用核磁共振方法分析物质时，物质分子中的原子核尤如一个精细的探针，允许核磁共振方法在分子、原子水平上探测物质，使我们得以深入了解物质的微观特性变化。NMR是在分子、原子水平上检测物质特性。原子核作为NMR的一个精细的探针探测物质的微观特性变化。NMR研究不损伤蛋白质样品。NMR可以检测包括化学反应，构象变化等动力学过程。核磁共振技术的优缺点天然状态下对样品进行探测提供原子分辨率上的结构及动力学信息灵敏度低,样品需要量大样品制备成本高可研究分子的分子量有限制仪器昂贵维护费用高核磁共振实验的灵敏度核磁共振实验的灵敏度一般用单位采样时间内的信噪比

来衡量：式中N为检测线圈内被检测磁性核数目，和样品的浓度有关；Q是线圈的品质因子，主要取决于探头本身；

e、

d是核的旋磁比，下标e，d分别代表激发核与检测核；B0是静磁场强度；T2是横向驰豫时间；T是实验温度；tmax是FID信号采样时间；Tc是不同次采样间总间隔时间（tmax加上循环时）；T1,e是激发核的纵向驰豫时间核磁共振波谱仪简介现代的核磁共振波谱仪是由超导磁体，包含由射频发生、功率放大、脉冲形成及控制、信号检测等各种功能电子器件的主机，以及用于设置和控制实验的计算机系统所组成。当今世界科学技术的发展也促进了核磁共振波谱仪的发展，不仅是谱仪本身已近乎于全数字化，而且已先后研制成静磁场强度更高（或共振频率更高）的超导磁体。已可提供使用的不仅有600MHz高场超导磁体，更有750MHz和800MHz超导磁体，900MHz超导磁体也已问世。核磁共振谱仪技术及实验方法的迅速发展大大扩展了核磁共振技术方法的应用范围。MagnetNMR实验样品NMR实验步骤二、NMR基本原理

原子核自旋运动：原子核的自身旋转运动。用“自旋角动量”描述核自旋运动；进行自旋运动的原子核都具有一定的自旋角动量；核自旋角动量的大小决定于核自旋量子数I；I表示某种原子核所固有的特性，不同的原子核I值不同；核自旋量子数I＝0,1/2,1,3/2,…(1)原子核的自旋运动(2)原子核的磁矩原子核带有一定的正电荷，可以认为这些电荷均匀地分布在原子核的表面；I0的原子核有自旋运动，因此正电荷也围绕着旋转轴旋转产生环电流，从而产生一个磁场；一般用磁矩来描述这种磁性质；核磁矩

＝gN

NI,

N是一个常数，称为核磁子

(gN

N)/ħ=

称为旋磁比

与粒子电荷和质量的比有关，不同的原子核有不同的

值(3)核磁共振条件在静磁场H0中,I0的原子核磁矩在磁场的作用下具有一定的能量；该能量决定于核磁矩在静磁场方向的投影与磁场强度乘积的负值

E＝－

zH0核磁矩在磁场中能量不连续，即能级分裂，能量差为

E＝

ħH0将能量为h

的射频场加到原子核上，如果h

＝E

，原子核就会在两个能级间跃迁，吸收电磁波能量；受激辐射和受激吸收的几率相同，在射频场作用下的净跃迁由上下能级的布居数之差决定。很小的布居数差表明核磁信号很弱，因此核磁共振的灵敏度很低。核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂（ZeemanSplitting),

原子核共振吸收一特定频率的射频(ω=

B)辐射,这一物理过程称为核磁共振现象。产生核磁共振的条件：

h

＝gN

NH0＝

ħH0

是电磁波频率

2＝

H0在同一静磁场中，不同种原子核的核磁共振频率不等，例如氢原子、碳原子以及氮原子的核磁共振频率各不相同，即使是同一种原子核，但各核在分子中所处的微环境不同，其共振频率也不尽相同。因此，核磁共振实验可以通过氢核检测质子核磁共振谱；通过碳核检测碳13核磁共振谱；通过氮核检测氮15核磁共振谱。几种核的性质核自旋

自然丰度(%)绝对灵敏度

核磁共振频率1H1/299.981.00600.132D10.0151.45

10-6

92.0613C1/21.111.76

10-4

150.7915N1/20.373.85

10-6

60.7719F1/21008.30

10-1

564.1823Na3/21009.25

10-2

158.6331P1/21006.63

10-2

242.76(4)NMR实验基础

核磁矩在磁场中以角频率

0围绕H0旋转

0=H0

0称为Larmor进动频率如果2=

0,那么核磁矩也要围绕射频场进动。NMR实验脉冲射频场是以脉冲形式加到样品上(5)NMR检测的是核磁矩自由感应衰减(FreeInductionDecay)信号，即FID信号(6)傅立叶变换(FourierTransformation)FID信号处理:运用傅立叶变换将FID时间域信号变换为频率域信号。单个射频脉冲的频谱：(7)NMR波谱1DNMR:

F(t)→F(f)

2DNMR:

F(t1,t2

)→F(f1,f2

)

3DNMR:

F(t1,t2

,t3)→F(f1,f2,f3

)

4DNMR:

F(t1,t2

,t3,t4

)→F(f1,f2,f3,f4

)(8)NMR实验对谱仪要求1、恒定的静磁场—超导磁场2

f=

H0

(2

f=2

)

(1H)≠

(13C)≠

(15N)≠…

0(1H)≠

0(13C)≠

0(15N)≠…f(1H)≠f(13C)≠f(15N)≠…2、稳定的脉冲频率和多射频通道提供多射频通道提供不同的脉冲实验技术脉冲程序(不同的脉冲组合)可以在实验中设置脉冲频率可以在实验中设置射频功率h

可以在实验中设置3、能够检测微弱的FID信号4、能够处理多维核磁共振实验数据三、NMR波谱参数1、化学位移(ChemicalShift)

同一种核在分子中不同化学环境下共振频率的位移称为化学位移

。核外电子在外磁场作用下，产生感应磁场，对外加磁场起一个屏蔽作用，产生化学位移。H(核)＝H0(1－

)

H(核)－原子核实际所感受的磁场

－屏蔽常数H0－外加磁场

的表示式:

＝{(Hm-Hs)/Hs}

106[ppm]Hm是测量值

Hs是标准样品值

与核所处的化学微环境有关;

与核所位于的局域结构有关;

受芳环的影响标准;

受溶剂效应影响.

提供的信息：①可以正确预测蛋白质中形成

螺旋和

折叠的氨基酸残基肽段;②可以正确指示蛋白质发挥生理功能的活性部位;③可以指示蛋白质与蛋白质，蛋白质与DNA和

RNA，蛋白质与药物小分子等相互作用的部位;④可以提供蛋白质构象变化的信息.RangeofChemicalShiftsof1H,13C,15NResonances1HChemicalShifts:1HN:6.0–11.0ppm1H

:2.5–6.0ppm1H

:2.0–4.5ppm1H

,

:1.0–3.0ppmCH3:0.0–1.5ppm1H(aromaticring):6.5–7.8ppm13CChemicalShifts:13C

:43–68ppm13C

,

,

:25–45ppm13C

(Serine):56–66ppm13C

(Threonine):58–72ppm13CH3:10–27ppm13C(aromatic):108–158ppm13C

:171–177ppm15NChemicalShifts:15N(amide):101

139ppm

40ppm15N(Histidinesidechain):165–222ppm15N(othersidechain):110–115ppm,&<108ppm2、自旋－自旋耦合常数

(spin-spincouplingorJ-couplingconstant)核磁矩通过围绕在核外的电子云间接传递作用而产生的自旋间的能量偶合J－耦合常数为[Hz]1HN-1H

J耦合常数的表示式(Karplus公式)

3J

N=6.4cos2

-1.4cos

+1.9

=

-60

是扭转角

是二面角①J值大小与外加磁场无关;②J值大小与耦合核之间成键数目有关;③J值大小与分子结构有关(在蛋白质中，

螺旋和

折叠氨基酸肽段中的J值大小不等);④J耦合常数(3J

N)与耦合核的扭转角有关.

J耦合常数可以提供的信息：

①在小分子中可以提供结构信息;②在蛋白质中可以描述主链及侧链的构象;③可用于分析蛋白质变性态中存在的残余结构;④为蛋白质和核酸的溶液三级结构的测定提供几何数据.3、NOE(NuclearOverhauserEffect,核欧沃豪斯效应)NOE反应原子核自旋之间通过空间的偶极－偶极相互作用;如果两个1H核间的距离小于5Å，那么在NMR谱中就可以观察到NOE信号(在蛋白质中也可观察到小于或等于6Å的NOE信号)

I∝1/dij6I–两个1H核间的NOE信号强度

dij

–两个1H核间的空间距离NOE信号强度与两个1H核间的距离有关;NOE与分子内部运动、化学交换有关;NOE与核自旋体系内的交叉弛豫有关;NOE信号强度可以提供的信息：①蛋白质中氢原子对之间的距离(是确定蛋白质溶液三级结构的最重要的数据);②蛋白质构象变化情况;③蛋白质与其靶分子相互作用的具体氨基酸残基.4、共振峰强度共振峰强度反应了在共振频率

产生NMR的核自旋数目①共振峰强度与蛋白质样品浓度有关;②表观共振峰强度与NMR谱的信噪比有关;③共振峰强度变化还与蛋白质分子中间存在的交换现象有关.

共振峰强度可以提供的信息:①在H/D交换实验中的强度变化常被用以分析蛋白质的内运动情况，指示氢键的强弱;②利用小分子与蛋白质分子结合时峰强度变化，可以分析小分子的结合情况.5、共振峰宽度(线宽

H)

H定义为共振峰高度等于1/2处的峰宽①与核自旋的局域相互作用有关

＝

|H0+Hlocal|②与核自旋的弛豫时间T2有关

H∝1/T2

H可以提供的信息：①蛋白质中氨基酸残基肽段的动态特性②蛋白质与其他生物分子相互作用的部位6、T1，T2弛豫时间(RelaxationTime)核自旋系统受外界作用(外加直流磁场和射频场