（正式版）DB11∕T 829-2011 《白菜品种纯度及真实性分子检测方法》

1 13术语与定义 14原理 2 2 2 3 49检测结果 6附录A(规范性附录)所用溶液的配置方法 8附录B(资料性附录)白菜品种纯度检测常用的SSR引物名称及序列 附录C(资料性附录)白菜真实性鉴定常用的ISSR引物名称及序列 附录D(规范性附录)白菜基因组DNA提取方法 15附录E(规范性附录)6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法 附录F(规范性附录)5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法 19工1简单重复序列(SSR),又称短串联重复序列或内部简单重复序列(ISSR),是利用包含重复序列并在3’端或5’端锚定的单寡聚核苷酸引物对基因25.1.2水浴锅(0℃~100℃)。5.1.3微波炉(额定功率800W)。5.1.6高速台式离心机(12000r5.1.8冰箱(最低温度-20℃)。5.1.16染色盒(55cm×38cm×8cm)。36.1.3盐酸(HCl)。6.1.8Tris-饱和酚。6.1.28二甲苯青FF。6.1.34溴化乙锭(EtBr)。6.1.35超纯水。4随机数取一定数量种子(保证100株幼苗)作为试样，进行幼苗培养。一10×PCR缓冲液10μmol/L上、下游引物溶液5表1SSR-PCR反应体系(续)总体积一液，加等体积超纯水。SSR-PCR反应温度、时间1个循环降落PCR变性：94℃,45s退火：60℃~51℃,1min10个循环，退火温度每1循环下降1℃变性：94℃,45s退火：50℃,45s35个循环最终延伸1个循环1个循环注：使用不同的PCR扩增仪，应对仪器进行调整。6ISSR-PCR终浓度ISSR-PCR体积一10×PCR缓冲液10μmol/L引物溶液总体积一如果10×PCR缓冲液中含有氯化镁，则积超纯水。ISSR-PCR反应温度、时间1个循环降落PCR退火：63℃~54℃,1min10个循环，退火温度每1循环下降1℃35个循环最终延伸1个循环1个循环鉴定SSR电泳谱带带型的一致性，计数供并按下列公式计算电泳测定值(品种纯度):79.2.2对相近品种和疑同品种，利用供检样品8(规范性附录)所用溶液的配置方法A.1DNA提取溶液的配制A.1.320%十二烷基硫酸钠(SDS)定容至100ml。9A.3.55%非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液A.3.825%过硫酸铵引物名称SSR引物序列(5'—3')下游CGTCGATCGATTCATAA下游AGCATCAACGCCAACTTTATCC下游AGGGAATGAGGATGGGT下游GTGGAATGGAAACCCCAGAA下游TTGAGCGTAGGCAGGAAAAT下游TTGAGCGTAGGCAGGAAAAT下游CTCTCCGGCTTCTTCCT下游CCCTTCCTACTTCCCCTCACAGAT下游CTCGTGGAAGCGGTTAC下游AAGGAAGCAGGAAAGAGATAAAAG下游TTAACAAAAGATCCAAAAAGAAAC下游GAACACTACTGCCCAGAGAACAC引物名称SSR引物序列(5'—3')上游CAAACTCCCCCAGATCC下游CGAGCGCGAACATGAGG下游TACGTGTTACATCTTTA引物名称AGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAGAGAGAGAGAGAAGAGAGAGAGAGAAGAGAGAGAGAGAAGAGAGAGAGAGAAGAGAGAGAGAGAAGAGAGAGAGAGAAGAGAGAGAGAGAGAG引物名称ISSR引物序列(5'—3')ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAACACACACACACA(规范性附录)白菜基因组DNA提取方法D.2.6每管加入70%乙醇300μL,12000r/min离心1min,清洗DNA,清洗过程重复2次。