CN119410707A 用于构建棉铃虫雄性不育系的方法及涉及的转化事件 （南京农业大学）

用于构建棉铃虫雄性不育系的方法及涉及本发明涉及用于构建棉铃虫雄性不育系的育系的方法。将含有Chr16_Vasa_Cas9转化事件的棉铃虫与含有Chr5_U6_S2sgRNA转化事件的棉铃虫杂交，获得共表达Cas9和sgRNA的杂交F1代构建棉铃虫雄性不育系提供了两种优选的转化身份识别以及对转基因棉铃虫进行追溯和监管2的棉铃虫与含有Chr5_U6_S2sgRNA转化事件的棉铃虫杂交，杂交F1代棉铃虫的HaSer2基因系；所述的含有Chr16_Vasa_Cas9转化事件的棉铃虫16号染色体第4,267,442和第4,267,Chr5_U6_S2sgRNA转化事件的棉铃虫5号染色体第4,681,215和第4,681,216碱基之间存在2.棉铃虫转化事件组合，其特征在于，由权利要求1中所述的Ch件和Chr5_U6_S2sgRNA转化3.根据权利要求2所述的棉铃虫转化事件组合，其特征在于棉铃虫转化事件Chr16_5.一种利用权利要求4所述的引物对检测棉铃虫样本中是否包含转基因棉铃虫转化事7.一种利用权利要求6所述的引物对检测棉铃虫样本中是否包含转基因棉铃虫事件(2)利用权利要求3所述的引物对以所述的基因组DNA为模板进行PCR扩增；(3)通过琼脂糖8.一种以棉铃虫Vasa启动子驱动Cas9表达的piggyBac转基因质粒，其特征在于，将Vasa_Cas9的融合片段重组至线性化的piggyBa片段.第一sgRNA表达盒片段和第二sgRNA表达盒片段同源重组至不含EGFP表达盒以及Cas93[0001]本发明属于生物技术领域，涉及两个棉铃虫转化事件Chr16_Vasa_Cas9和Chr5_U6_S2sgRNA的侧翼序列和分子鉴定及其用于构建棉铃虫雄性基因Cas9基因和靶向雄性生殖调控关键基因的sgRNA序列整合入昆虫基因组中，转基因昆为外源基因的插入导致昆虫内源基因结构被破坏，进而使昆虫表现出适合度代价(HuangY,LiuZ,RongYS.GenomeEditing:FromDrosophilatoNon_ModelInsectsand转化事件包含Chr16_Vasa_Cas9和Chr5_U6_S2sgRNA。所述的Chr16_Vasa_Cas9转化事件表4转化事件表达sgRNA序列，该sgRNA靶向棉铃虫的雄性生殖调控关键基因HaSer2，并以mCherry作为转基因阳性个体的筛选标记。通过检测所述的两种棉铃虫转化事件的侧翼序含Chr16_Vasa_Cas9和Chr5_U6_S2sgRNA转化事件。通过将包含Chr16_Vasa_Cas9转化事件的棉铃虫与包含Chr5_U6_S2sgRNA转化事件的棉铃虫杂交，可使杂交F1代棉铃虫体内的以为在棉铃虫中构建雄性不育系并开发高效的棉铃虫防治策略提供Chr16_Vasa_Cas9和可以为对其进行身份识别以及追溯和监管提供重要的科学[0007]第一方面，本发明提供了棉铃虫转化事件Chr16_Vasa_Cas9的外源基因和侧翼序[0008]第二方面，本发明提供了用于检测上述棉铃虫转化事件Chr16_Vasa_Cas9的引物[0011]第四方面，本发明提供了棉铃虫转化事件Chr5_U6_S2sgRNA的侧翼序列和外源基[0012]第五方面，本发明提供了用于检测上述棉铃虫转化事件Chr5_U6_S2sgRNA的引物转化事件构建棉铃虫雄性不育系的方法，所述方法通过将含有Chr16_Vasa_Cas9转化事件的棉铃虫与含有Chr5_U6_S2sgRNA转化事件的棉铃虫杂交，杂交后的棉铃虫F1代个体中5卵量未发生显著变化(表1)，说明Chr16_Vasa_Cas9转化事[0019]本发明提供了两个优选的棉铃虫转化事件Chr16_Vasa_Cas9和Chr5_本发明构建的棉铃虫雄性不育系防治棉铃虫的优点在于：(1)防治效果更为显著且绿色无[0021]通过明确两个棉铃虫转化事件Chr16_Vasa_Cas9和Chr5_U6_S2sgRNA的侧翼序列[0026]图5将含有Chr16_Vasa_Cas9转化事件的棉铃虫与含有Chr5_U6_S2sgRNA转化事件[0027]图6棉铃虫雄性不育个体与野生型雌性个体交配后所产卵的发育状态，与野生型6[0031]使用棉铃虫基因组DNA为模板，用含有同源臂的引物扩增HaVasa基因的启动子序动子序列扩增成功，切胶该条带并进行胶回收。胶回收步骤使用南京诺唯赞的FastPureGelDNAExtractionMini7PCR产物加入1％的琼脂糖凝胶中电泳检测，检测到单一明亮的4140bp的条带后，则说明Cas9基因的ORF序列扩增成功，切胶该条带并进行胶回收。胶回收步骤使用南京诺唯赞的FastPureGelDNAExtractionMini[0042]以Vasa基因启动子序列和Cas9的ORF序列为模板，使用上述F1和R2引物进行融合[0046]电泳检测PCR产物并切胶回收：在PCR产物中加10μLLoadingBuffer，将全部的Cas9融合片段序列扩增成功，切胶该条带并进行胶回收。胶回收步骤使用南京诺唯赞的FastPureGelDNAExtractionMini[0048]使用piggyBac背景质粒pBac[IE1_EGFP_IE1_Cas9_SV40](刘群.家蚕嗅觉相关基8的引物扩增不含IE1_Cas9序列的线性化piggyBac质粒，其中上游引物F3序列为5’_用南京诺唯赞的FastPureGelDNAExtractionMin子驱动Cas9表达的piggyBac转基因质粒，同源重组反应体系如下(使用南京诺唯赞的One平板上挑取单一且大小适合的菌斑加入950μLLBAmp+培养基，37℃摇床上250rpm12h后，和Vasa启动子驱动Cas9表达的piggyBac转基因质粒混合并均稀释至400ng/μL，使用9Eppendorf公司的FemtoJetandInjectManNI2microinjectionsystem将上述混合溶液成虫后与棉铃虫背景品系SCD交配来扩大种群数量后，根据Li等人(LiL,ZuoY,ShiY,YangY,WuY.OverexpressionoftheF116ValleleofCYP9A186intransgenicHelicoverpaarmigeraconfershigh_levelresistancetoemamectinbenzoate.InsectBio定方法，检测到该转基因棉铃虫体内外源基因位于基因组第16号染色体第4,267,442和第[0060]棉铃虫转化事件Chr16_Vasa_Cas9的侧翼序列位于棉铃虫基因组第16号染色体4,[0062]使用FastPureCell/Tis背景品系SCD和含有Chr16_Vasa_Cas9转化事件增出预期的约800bp大小的目标条带，说明该对特异引物能够用于精准鉴定Chr16_Vasa_的特定棉铃虫转化事件，本例首先构建了棉铃虫U6启动子驱动sgRNA表达的piggyBac转基因质粒，随后使用piggyBac转座系统将该质粒导入棉铃虫基因组中，获得了表达靶向外源基因位于31号染色体的棉铃虫转化事件Chr5_U6_S2sgRNA，并根据该转化事件的序列信息，设计了相应的特异性引物，并确认了这些特异性引物可用于鉴定棉铃虫转化事件TGCTTGTCATTTATTAATTTGGATG_3’)分别以合成的mCherryDNA(GenBank：MZ027319.1)和piggyBac背景质粒pBac[IE1_EGFP_IE1_Cas9_SV40](刘群.家蚕嗅觉相关基因的功能研究京诺唯赞的FastPureGelDNAExtractionMini[0074]再以mCherry和Hr5_IE1的DNA片段为模板，用上述F5/R4引物进行PCR，扩增PCR产物加入1％的琼脂糖凝胶中电泳检测，检测到约1975bp的Hr5IE1_mCherry片段条带GelDNAExtractionMini序列为5’CCGCAGTGCAACTTGGGTCCACTTGCAGGGAACGAAA_3’)和F7AGTTGCACTGCGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG_3’，下游引物R7序列为5’_GGCCCCTCATCAATGTATCTTAACGCGAG_3’)分别以棉铃虫SCD品系基因组DNA和gRNA的DNA模板为模板(gRNA的DNA模板来源于已发表的文章JiangD,YuZ,HeY,etal.KeyroleoftheryanodinereceptorI4790KmutationinmediatingdiamideresistanceinPlutellaxylostella.2024.InsectBiochemMolBiol.)，PCR得到HaU6启动子片段和PCR产物加入1％的琼脂糖凝胶中电泳检测，检测到约620bp的HaU6条带和约80bp的sgRNA诺唯赞的FastPureGelDNAExtractionMiniK唯赞的FastPureGelDNAExtractionMiniAGATACATTGATGAGGGGCCCAAATTATGTATTTAAAACAAAGGTTTATTTTATT_3’，下游引物R8序列为5’TGTCTTGTTTTGCCCCATCCACTTGCAGGGAACGAAAT_3’)和F9/R9(FPCR产物加入1％的琼脂糖凝胶中电泳检测，检测到约600bp的HaU6条带和约80bp的sgRNA诺唯赞的FastPureGelDNAExtractionMiniK唯赞的FastPureGelDNAExtractionMini[0099]使用piggyBac背景质粒pBac[IE1_EGFP_IE1_Cas9_SV40](刘群.家蚕嗅觉相关基的引物扩增不含EGFP表达盒和Cas9表达盒序列的线性化piggyBac质粒，其中上游引物F10回收步骤使用南京诺唯赞的FastPureGelDNAExtractionMin至不含EGFP表达盒以及Cas9表达盒的线性化piggyBac质粒，构建表达靶向HaSer2基因和表达靶向HaSer2基因的sgRNA的piggyBac转基因质粒混合并均稀释至400ng/μL。使用Eppendorf公司的FemtoJetandInjectManNI2microinjectionsystem将上述混合溶液养至成虫后与棉铃虫背景品系交配来扩大种群数量后，根据Li等人(LiL,ZuoY,ShiY,YangY,WuY.OverexpressionoftheF116ValleleofCYP9A186intransgenicHelicoverpaarmigeraconfershigh_levelresistancetoemamectinbenzoate.InsectBio[0112]棉铃虫转化事件Chr5_U6_S2sgRNA的侧翼序列位于棉铃虫基因组第5号染色体4,设计特异性引物鉴定棉铃虫转化事件Chr5_U6_S2sgRNA的分子特征，其中第一引物与侧翼[0114]使用FastPureCell/Tis[0118]实施例3利用Chr16_Vasa_Cas9和Chr5_U6_S2sgRNA转化事件构建棉铃虫雄性不育系[0119]通过将实施例1中的含有Chr16_Vasa_Cas9转化事件的棉铃虫与实施例2中的含有Chr5_U6_S2sgRNA转化事件的棉铃虫杂交，获得共表达Cas9和sgRNA的杂交F1代棉铃虫后，[0121]将实施例1中获得的含有Chr16_Vasa_Cas9转化事件的棉铃虫成虫，与实施例2获得的含有Chr5_U6_S2sgRNA转化事件的棉铃虫成虫交配，所得F1代即为同时含有两种转化事件的棉铃虫。