CN119422059A 用于诊断和治疗癌症的免疫组织化学（ihc）方案和方法 （安捷伦科技有限公司）

2024.12.19PCT/US2023/0250012023.06.09WO2024/006052EN2024.01.04组织样本中的蛋白癌胚抗原相关的细胞粘附分子5或CEACAM5的表达程度进行确定和评分的免了用于使用如本文所提供的IHC方法诊断、治疗或改善癌症或肿瘤或评定所述癌症或肿瘤的复法的组分和使用说明书。本申请描述了用于对CEACAM5表达进行评分并利用得分作为伴随或补21.一种用于对组织样本中癌胚抗原相关的细胞粘附分子5(CEACAM5)的细胞膜表达程样本的至少一部分中染色和未染色的有活力肿瘤或癌其中如果存在高于定义阈值的任何强度的CEACAM5细胞膜染色，则肿瘤或癌细胞被计其中所述肿瘤强度比例得分是在所述组织样本中存在的CEACAM5染色的有活力肿瘤或2.根据权利要求1所述的方法，其中所述CEACA3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中计数为阳性胞的总数包括具有与所述阳性染色管腔相关联的细胞膜的6.根据权利要求1所述的方法，其中计数为阳性染色的肿瘤或癌细胞排除具有细胞质7.根据权利要求6所述的方法，其中细胞质染色包括2+或更小阳性染色强度的细胞质8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中9.根据权利要求8所述的方法，其中所述确定的阈值包括在色强度染色的CEACAM5有活力肿瘤或癌细胞的数目除以染色和未染色的有活力肿瘤或癌细11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中约40％或更大的肿瘤强度比例得分3大的阳性染色强度染色的CEACAM5有活力肿瘤或癌细胞的数目；或约10％或更大的肿瘤强度比例得分包括以2+或更大的阳性染色强度染色的CEACAM5有活力肿20.根据权利要求18所述的方法，其中通过包括在小时至约72小时的时段的方案来制备所述组织21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤或癌症是非鳞状非小细胞23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用明视场光学显微镜、显微镜物25.一种通过确定组织样本是否对癌胚抗原相关的细胞粘附分子5(CEACAM5)的表达呈26.根据权利要求25所述的方法，其中所述肿瘤或癌症是非鳞状非小细胞肺癌27.一种用于治疗或改善患者的肿瘤或癌症至25中任一项所述的方法对来自所述患者的组织样本中的CEACAM5的量进行确定和评分，其中如果所述组织样本被确定或评分为具有高的或诊断阳性的CEACAM5得分，则用所述患28.根据权利要求27所述的方法，其中所述肿瘤或癌症是非鳞状非小细胞肺癌429.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述癌症治疗包括向所述患者施用抗癌药30.根据权利要求29所述的方法，其中所述抗癌疗法包含抗体药物缀合物、小分子疗31.一种试剂盒，所述试剂盒包含特异性结合如前述权利要求中任一项所述的方法中32.一种用于评定CEACAM5表达程度的方法，所肿瘤细胞的样本或其部分与特异性结合CEACAM5的抗体或其部分接触；以及通过以下方式确定肿瘤强度比例得分：将所述样本或其部分中被所述抗体特异性结合的CEACAM5染色的有活力肿瘤或癌细胞的数目除以染色和未染色的有活力肿瘤或癌细胞的总数并将结果乘5方式中，提供了用于可再现地对组织样本中的蛋白癌胚抗原相关的细胞粘附分子5或CEACAM5(也称为CD66e(分化簇66e))的表达程度进行确定和评分的免疫组织化学明书。本申请描述了用于对CEACAM5表达进行评分并利用得分作为伴随或补充诊断或治疗[0002]癌胚抗原相关的细胞粘附分子5(carcinoembryonicantigen_relatedcelladhesionmolecule5,CEACAM5)也被称为CD66e(分化簇66e)，是癌胚抗原[0003]癌胚抗原相关的细胞粘附分子5(CEACAM5)是一种在几种肿瘤类型中过表达的细起关键作用。[0004]在替代实施方式中，提供了用于对组织样本中的癌胚抗原相关的细胞粘附分子5或CEACAM5(也称为CD66e(分化簇66e))的细胞膜表达程度进行确定和评分的免疫组织化学组织样本的至少一部分中染色和未染色的有活力[0007]其中如果存在高于定义阈值的任何强度的CEACAM5细胞膜染色，则肿瘤或癌细胞[0009]其中肿瘤强度比例得分是在所述组织样本中存在的CEACAM5染色的有活力肿瘤或6[0013]计数为阳性染色的有活力肿瘤或癌细胞的总数包括具有与阳性染色管腔相关联[0015]计数为阳性染色的肿瘤或癌细胞排除具有细胞质染色、正常或非瘤结构的染色、阳性或3+阳性染色强度；或者进一步包括在约20X至约40X的放大倍率下确认阳性染色强[0017]所述肿瘤强度比例得分(TIPS)包括以2+或更大的阳性染色强度染色的CEACAM52+或更大的阳性染色强度染色的CEACAM5有活力肿瘤或癌细胞的数目；或者约10％或更大的TIPS包括以2+或更大的阳性染色强度染色的CE[0021]所述组织样本包括福尔马林固定、石蜡包埋(formalinfixed,paraffin[0022]通过包括在约10％中性缓冲福尔马林中固定约6小时至约72小时的时段的方案[0023]所述肿瘤或癌症是非鳞状非小细胞肺癌(nonsquamousnonsmallcelllung7大强度的CEACAM5细胞膜染色的肿瘤癌细胞的肿瘤强度比例得分为诊断阳性的。在替代实行确定和评分，其中如果所述组织样本被确定或评分为具有高的或诊断阳性的CEACAM5得[0029]所述肿瘤或癌症是非鳞状非小细胞肺癌(nsNSCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、腺[0034]使来自个体的包含癌症或肿瘤细胞的样本或其部分与特异性结合CEACAM5的抗体结合的CEACAM5染色的有活力肿瘤或癌细胞的数目除以染色和未染色的有活力肿瘤或癌细8子5或CEACAM5(也称为CD66e(分化簇66e))的表达程度进行确定和评分的免疫组织化学(IHC)方法。在替代实施方式中，提供了评定肿瘤或癌症例如非鳞状非小细胞肺癌创造更大的实验室间和研究间可比性，并允许CEACAM5在临床实践中的早期有效应用的稳[0044]用于CEACAM5的当前免疫组织化学评分方法测量组织样本中表现出全膜染色和管织样本中的各种细胞之间的膜和管腔染色模式的存在或相对染色强度的个别确定也可能中仍然需要更简单且更有效的，以及稳健、可再现且准确的评分方法来评定组织样本中中TIPS是在组织样本中存在的CEACAM5染色的有活力肿瘤或癌细胞的数目除以染色和未染所有类型的有活力肿瘤或癌细胞的优点。此类实施方式可提供用于对组织样本中的9CEACAM5的细胞膜表达进行评分的简化I定中排除具有特定结构或特性的染色细胞，来提供增加CEACAM5评分方法的准确性和可再定义阈值包括在约4X至约10X的放大倍率下评估的2+阳性或3+阳性染色强度。在某些实施施方式中，肿瘤强度比例得分包括以2+或更大的阳性染色强度染色的CEACAM5有活力肿瘤TIPS包括以2+或更大的阳性染色强度染色的CEACAM5有活力肿瘤或癌细胞的数目；或约10％或更大的TIPS包括以2+或更大的阳性染色强度染色的CEACAM5有活力肿瘤或癌细胞的瘤细胞呈现在相同的10X视野内时，使用用于评估具有可能掩盖膜染色的强(3+)细胞质染施方式中，如本文所提供的CEACAM5IHC是在福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织样本(例如肺癌组织样本)的检测中使用抗CEACAM5抗体(例如单克隆小鼠抗CEACAM5克隆769)的[0053]在替代实施方式中，如本文所提供的CEACAM5IHC用作鉴定患有肿瘤或癌症的患症或肿瘤细胞的样本或其部分与特异性结合CEACAM5的抗体或其部分接触；以及通过以下方式确定肿瘤强度比例得分：将样本或其部分中被抗体特异性结合的CEACAM5染色的有活力肿瘤或癌细胞的数目除以染色和未染色的有活力肿瘤或癌细胞的总数并将结果乘以尔马林中固定约6小时至约72小时的时段的方案来制备组织样本的切片。在某些实施方式与克隆769抗体具有基本上类似的对CEAsmallcelllungcancer,nsNSCLC)、非小细胞肺癌(non_smallcelllungcancer,[0060]本文的实施方式提供了用于通过确定组织样本是否对于癌胚抗原相关的细胞粘供的方法对来自患者的组织样本中的CEACAM5的量进行确定和评分，其中如果所述组织样本被确定或评分为具有高的或诊断阳性的CEACAM5得分，则用患者可能有利地响应于的癌症治疗或抗癌疗法来治疗所述患者。所述肿瘤或癌症可以是非鳞状非小细胞肺癌像或数据分析系统来实践本领域中已知的IHC或IHC试剂，例如如在美国专利号(USPN)10,634,590(描述了用于IHC的载玻片架组件夹具)；10,565,47动化组织染色系统中处理试样的方法)；10,393,633织样本薄切片内的特定组织对象的发色染色剂的情况下如在明场显微镜中成像的对所述组织对象的检测)；US2019/0156510A1(描述了一种用于分析IHC组织样本的图像分析方法)；US2019/0293637A1(用于靶蛋白分子的定量免疫组织化学(IHC)的方法和系统)；US2019/0080450A1(描述了经IHC染色的生物样本的染色品质的自动化测定)；或者US2020/0316589A1(描述了一种用于处理和测试固定生物材料的多孔固体支持容器)中所[0068]在替代实施方式中，在如本文所提供的IHC方案或试剂盒中使用的如本文所提供琥珀酰亚胺酯；AlexaFluor488琥珀酰亚胺酯；BODIPY493/503C3琥珀酰亚胺酯；DY_也可以使用3,3'二氨基联苯胺(DAB)。二聚体抗原结合蛋白(包括例如合成或重组形式)[0076]取决于固定和组织保存的方法，样本可能需要附加步骤来使CEACAM5表位可用于[0077]在替代实施方式中，使用EnVisionDuoFLEXDoublestainSystemTM(EnVision盒包括例如单克隆小鼠抗CEACAM5抗体(例如克隆769抗CEACAM5抗体)，和/或用于实践IHC可以进一步包括用于实践如本文所述的方法的使[0080]任何上述方面和实施方式可以与本文在发明内容、附图和/或具体实施方式部分释为断言或承认任何文件的任何部分内容被认为是满足任何国家或地区专利申请法定公院认为对所要求保护的标的至关重要的材料的权利。如如在Sambrook等人，(2012)MolecularCloning:ALaboratoryManual，第4版，ColdMolecularBiology,CurrentProtocols,USA中的第1卷和第2卷中所述。标准分子生物学技术的其他参考文献包括Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual，第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY；Brown(1998)Molecular[0090]图1示出了使用CEACAM5IHC(抗体克隆)769测定在非鳞状NSCLC中进行CEACAM5染的膜染色的区域，并且细胞被评分为CEACAM5阳性，因为10X物镜视野内的肿瘤细胞(黑色[0096]图7示出了图像，所述图像表明只有肿瘤细胞(黑色(或更长)箭头)被评分为木精和伊红)染色；并且图10B示出了在巢状的管腔部分中20X的CEACAM5阳性顶端膜染色，[0102]图13A至图13B示出了具有印戒形态的细胞的H&E染色(图13A)和CEACAM5染色(图果可以确认活力，那么应使用如本文所提供的CEACAM5评分方案来对所述有活力肿瘤细胞[0105]图16A至图16B示出了图像，所述图像表明粘蛋白可以高强度染色(H&E染色为图[0106]图17A至图17B示出了阳性对照组织图像：10X(图17A)和20X(图17B)下的非鳞状[0112]图20示出了汇总使用如本文所提供的CEACAM5染色方案进行的研究的结果的表[0115]本文提供了用于评估已用小鼠单克隆CEACAM5抗体(命名为小鼠mAb克隆769)染色CEACAM5IHC769测定中提供以用于使用DakoOmnis自动化染色系统鉴定福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的非鳞状NSCLC试样中的CEA针对所评估的每个试样完成方案特定的病理学报告表(PathologyReportForm,PRF)(包[0119]CEACAM5阳性染色定义为≥2+强度的任何部分或完全肿瘤细胞质膜染色。膜染色[0127]对于显示腺管腔的腺癌，CEACAM5部分质膜染色可能出现为细胞的管腔方面的顶0否否是是[0146]使用4X至10X显微镜物镜对≥2+的CEACAM5阳性肿瘤染色进行评分。所述20x物镜可用于鉴定和/或确认在4X和10X物镜下可能不明显的1+和点状和/或精细的2+膜染色强度[0147]正在评估非鳞状NSCLC组织样本的此测定。H&E染色的载玻片应伴随每个CEACAM5排除的载玻片的非肿瘤部分区别。H&E和NCR染色的载玻片也有助于鉴别固有色素(由于固[0149]管腔染色：在肺腺癌中可以观察到显示管腔(顶端膜)染色的结构的两种形态模腺管腔的实体瘤巢的肿瘤可能显示管腔的CEACAM5顶端膜染色。在强度≥2+的管腔染色的当在高细胞质染色细胞的10x物镜视野内的肿瘤细胞中鉴定到阳性膜染色时，可以推断高[0155]细胞质内管腔：具有管腔染色≥2+强度的细胞质内管腔的细胞被视为阳性(图[0165]阳性对照组织和阴性对照组织与患者组织平行地运行。在对照组织上运行NCR染[0167]对照肿瘤组织应该从预先筛选的非鳞状NSCLC组织中鉴别出来。对照应为新鲜的[0185]·如果对照组织载玻片不满足要求，则测试试样结果应视为无效并且应重复染[0189]使用阴性对照试剂来代替CEACAM5特异性一抗，并帮助解释抗原位点处的特异性[0197]阴性对照试剂(NCR)应使用每个患者试样的切片进行检查，以评估非特异性染色[0204]个别强度下的染色的示例在图8中示出。整个组织切片中的总有活力肿瘤细胞的[0205]非鳞状NSCLC试样的CEACAM5诊断状态(阳性/阴性)由表达CEACAM5阳性(≥2+强[0210]对于CEACAM5免疫组织化学染色和评分的评估，可使用4X物镜放放大倍率对整个[0219]出现在一些试样中的内源性色素的示例，以及如何将它们与真正的CEACAM5染色[0220]基于≥2+强度水平的CEACAM5阳性染色的预先确定的截止点来确定CEACAM5阳性这些组织元件的染色被排除在确定CEACAM5表达状态和评估非特异性背景染色之外(参见以用于详细说明，然而也可以在4X和/或10X物镜下测量CEACAM5阳性膜染色％的评分和计镜视野内的肿瘤细胞中鉴定到阳性膜染色时，可以推断具有高细胞质染色的细胞为阳性。肿瘤细胞具有可辨别的膜染色并且指示该区域为高度CEAC[0227]图5示出了例示性良性组织染色示例：正常(非肿瘤形成)组织的染色，如在此所坏死区域应被排除在使用如本文所提供的CEACAM5评分方案的评分之外，并且不被视为非[0229]图7示出了图像，所述图像表明只有肿瘤细胞(黑色(或更长)箭头)被评分为木精和伊红)染色；并且图10B示出了在巢状的管腔部分中20X的CEACAM5阳性顶端膜染色。[0235]图13A至图13B示出了具有印戒形态的细胞的H&E染色(图13A)和CEACAM5染色(图果可以确认活力，那么应使用如本文所提供的CEACAM5评分方案来对所述有活力肿瘤细胞[0238]图16A至图16B示出了图像，所述图像表明粘蛋白可以高强度染色(H&E染色为图[0239]图17A至图17B示出了阳性对照组织图像：10倍(图17A)和20X(图7B)下的非鳞状和右下角的两个下部箭头和图像右上角的箭头)强度膜染色的范施例展示了如本文所提供的CEACAM5染色方案的使[0247]使用DakoOmnis仪器，对≥2+强度≥50％CEACAM5阳性肿瘤细胞的FFPE非鳞状究的结果用于根据适用的监管指南来证明测定的[0248]CEACAM5IHC769是使用单克隆小鼠抗CEACAM5克隆769的定性免疫组织化学(IHC)测定，旨在用于检测福尔马林固定、石蜡[0249]CEACAM5IHC769测定用作辅助以鉴定可能受益于参与使用开发中的SanofiSAR408701(Tusamitamabravtansine)作为用于患有晚期非鳞状NSCLC的患者的治疗的临[0250]抗CEACAM5抗体一药物缀合物Tusamitamabravtansine是一种由与细胞毒性剂缀[0251]本研究的目的是评估CEACAM5IHC769在以≥50％CEACAM5阳性肿瘤细胞≥2+强[0252]如果以≥2+强度表达CEACAM5的肿瘤细胞百分比≥50则诊断终点被定义为阳[0258]本研究是一项对FFPE人类非鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)组织试样的CEACAM5IHC[0262]基于≥50％的CEACAM5阳性肿瘤细胞中≥2+强度的截止值，尝试选择代表全部范围的生物标志物表达的试样，其中阳性和阴性样本的分布平衡。大约20％的试样选自≥40％至≤60％的CEACAM5阳性肿瘤细胞≥2+强[0266]使用以下方法对研究部分A(站点间和站点内)和研究部分B(观察者间和观察者[0270]CEACAM5染色百分比得分(连续数据)的可变性通过用站点和轮次(研究部分A)以名观察者的CEACAM5阳性和阴性状态的≥2+强度≥50％的截止值的可再现性结果符合NPA、PPA和OA可再现性估计值的置信(CI)下限≥8[0275]此研究被设计为评定CEACAM5IHC769在三个经CLIA认证的独立临床实验室中的化的FFPE组织切片。研究中的所有试样均由在CEACAM5的评分方面认证的病理学家进行评[0276]本研究被设计为基于以下来调查CEACAM5IHC769的[0277]部分A和部分B的样本分布基于阴性、阳性和接近截止值样本的预定义CEACAM5阳40％至60％的CEACAM5阳性肿瘤细[0283]研究的此部分使用66张永久装片的CEACAM5、NCR和H&E染色载玻片的单个集合进估4个通配符试样的集合(每个集合对每次读数都是唯一的)，但该集合不包括在数据分析部分B的三次评分评估的各次评分评估(读数)之间都有14天至3[0293]CEACAM5IHC769含有使用DakoOmnis完成FFPE试样的免疫组织化学(IHC)染色[0298]CEACAM5IHC769含有使用DakoOmnis完成FFPE试样的IHC染色程序所需的优化抗分子和与葡聚糖聚合物主链偶联的辣根过氧化物酶分子组成的即用型显色试剂一起孵[0300]染色的解释遵循IFU(D60362)中的评分指南和针对nsNSCLC试样的CEACAM5IHC769病理学评分手册中的详细评分方法D55521)。CEACAM5阳性染色被定义为≥2+强度的任[0303]根据研究方案和外部试样选择和审查指南选择组织试样。表3中显示了以试样数量(n)和占总集合的百分比(％)表示的本研究中选择的nsNSCLC[0308]此可再现性研究采用≥50％的CEACAM5阳性肿瘤细胞的肿瘤细胞膜上≥2+染色强[0309]对整个试样进行评估。对整个CEACAM5染色的载玻片上的所有有活力的肿瘤细胞告为近截止值的试样基于研究病理学家的连续得分的中值是否在近截[0328]表4.基于每份试样的外部病理学家原始得分的中值，≥2+强度≥50％截止值的[0337]本研究的目的是证明Agilent针对CEACAM5IHC769测定的评分方法和解释指南[0353]可再现性研究中的基础连续原始CEACAM5得分也是基于方差分析模型(ANOVA)进处理的50个nsNSCLC试样的ANOVA[0364]本实施例中的数据提供了在评估nsNSCLC病例的情境内，在≥2+强度≥50％截止[0367]在替代实施方式中，提供了用于对组织样本中的癌胚抗原相关的细胞粘附分子5或CEACAM5(也称为CD66e(分化簇66e)的细胞膜表达程度进行确定和评分的免疫组织化学[0369]确定具有CEACAM5细胞膜染色的有活力的肿瘤或癌细胞的总数，以及确定所述组织样本的至少一部分中染色和未染色的有活[0370]其中如果存在高于定义阈值的任何强度的CEACAM5细胞膜染色，则肿瘤或癌细胞[0372]其中肿瘤强度比例得分是在所述组织样本中存在的CEACAM5染色的有活力肿瘤或[0375]有活力肿瘤或癌细胞的总数包括试样中所有有活力的肿瘤或癌细胞，包括管腔[0376]计数为阳性染色的有活力肿瘤或癌细胞的总数包括具有与阳性染色管腔相关联[0377]所述组织样本包含至少约100个阳性或3+阳性染色强度；或者进一步包括在约20X至约40X的放大倍率下确认阳性染色强[0380]所述肿瘤强度比例得分(TIPS)包括以2+或更大的阳性染色强度染色的CEACAM52+或更大的阳性染色强度染色的CEACAM5有活力肿瘤或癌细胞的数目；或者约10％或更大的TIPS包括以2+或更大的阳性染色强度染色的CE[0384]所述组织样本包括福尔马林固定、石