AKTA蛋白纯化系统操作流程

实验室新员工培训AKTA蛋白纯化系统操作流程从开机到收尾的完整操作指南日期2026年内容导览01系统认知认识AKTA的组成、原理与应用02操作流程从开机到收尾的标准步骤03风险防控注意事项与维护保养要点04故障应对常见问题排查与处理CHAPTER系统认知认识仪器，是安全操作的第一步了解AKTA的组成、原理与核心能力01什么是AKTA纯化系统AKTA是应用于生物制药、农学研究与微生物学领域的多功能层析系统，用于天然蛋白及重组蛋白的高精度分离纯化系统定义3项系统定义AKTA是应用于生物制药、农学研究与微生物学领域的多功能层析系统，用于天然蛋白及重组蛋白的高精度分离纯化四重检测集成紫外检测、电导、pH及温度四重在线检测模块，支持

190–700nm

波长范围实时光谱监测UNICORN软件搭载UNICORN智能控制软件，实现洗脱梯度编程、自动组分收集与全流程自动化操作核心参数流速范围0.001–25mL/min双泵模式可达

50mL/min最大工作压力20MPa检测灵敏度0.1μg/mL蛋白浓度变化，适配微量样本纯化系统的组成与工作原理利用不同物质在固定相与流动相间的吸附、分配差异，通过改变洗脱条件将目标蛋白与杂质依次洗脱分离工作原理：利用不同物质在固定相与流动相间的吸附、分配差异，通过改变洗脱条件将目标蛋白与杂质依次洗脱分离；检测器实时跟踪流出液成分，指导目标峰收集。系统由

泵、层析柱、检测器、收集器

四大核心部件协同工作泵系统全自动微量注射泵，输送缓冲液与样品，提供稳定流速。层析柱填装分离介质，是蛋白分离发生的核心场所。检测器紫外（280nm）、电导、pH模块实时监测流出液成分变化。收集器根据体积或峰信号自动收集目标组分。常见层析技术与应用AKTA支持多种层析技术，按分离原理可分为四类：特异性结合亲和层析分离依据·特异性结合典型应用：抗体、标签蛋白纯化电荷差异离子交换层析分离依据·电荷差异典型应用：根据等电点分离蛋白分子大小凝胶过滤层析分离依据·分子大小典型应用：脱盐、分子量分级疏水性差异疏水层析分离依据·疏水性差异典型应用：高盐条件下结合分离CHAPTER操作流程每一步规范，决定每一次结果从开机准备到实验收尾的标准操作02开机与系统初始化开启设备与登录软件前，规范检查与参数设置是稳定运行的前提01检查电源线、管路连接，废液管插入废液瓶且管口高于液面02长按仪器电源键，待自检完成、主机控制面板白灯常亮03启动电脑，双击UNICORN软件图标登录04进入SystemControl界面，确认系统显示Ready、连接正常05设置柱压上限（按层析柱说明书，常用预装柱为0.3MPa），UV检测器执行AutoZero调零UNICORN登录后弹出四个界面Administration用户管理SystemControl手动操作Evaluation图谱分析MethodEdit方法编辑缓冲液与样品准备缓冲液处理A平衡液/B洗脱液经

0.22或0.45μm滤膜

过滤有机溶剂须

超声脱气10分钟，防止气泡干扰4℃保存须恢复至室温后再过滤脱气VS样品处理澄清过滤经

0.22μm滤膜

过滤离心取上清或

12000rpm、10min离心

取上清层析要求浓度、体积、pH、盐浓度须

符合层析填料要求所有溶液当日配制当日使用，是保证结果重复性的第一道关口管路清洗与排气1插入超纯水管路插入超纯水，进入

SystemControl→Manual→ExecuteManualInstructions→Pump2选择洗泵选择

PumpAWash

与

PumpBWash，选中

A1、B1

入口，点击

Execute

洗泵3液体置换洗泵完成后将管路插入缓冲液瓶，再次执行洗泵完成液体置换4排净气泡仍有气泡时：Manual→Flowpath→PurgeValveON，低流速（约

1mL/min）冲洗至无气泡5恢复流路排气完成后关闭

Purge，恢复流路气泡进入系统会导致

UV基线不稳、压力异常，务必彻底排净务必彻底排净，确保系统稳定运行层析柱安装要点装柱前设置防气泡连接报警压：取层析柱与填料说明书中较小的最大耐受压力值流速设置

0.5–1mL/min，先开泵再连接柱子待上端管口持续出液后，取下柱上端堵头，液滴滴入柱顶排出空气先接上端勿拧紧，再松开下端堵头；上端拧紧的同时下端缓慢松开下端有液滴流出后再连接下游管路，拧紧后检查是否漏液严禁带气连接层析柱，否则影响分离效果系统平衡与基线检查平衡缓冲液以1–2mL/min冲洗层析柱，至少2–3个柱体积（CV），观察UV、电导、pH三条曲线直至完全平稳无漂移，平衡完成后执行UV调零。三线平稳是判断系统平衡完成的客观标准，任何一条不稳定都提示系统可能仍有气泡或残留液体未置换完全。平衡缓冲液冲洗条件A液以

1–2mL/min

冲洗层析柱，至少

2–3个柱体积（CV）。观察曲线平稳标准UV、电导、pH三条曲线直至

完全平稳、无漂移、无尖锐峰。UV调零零点校准平衡完成后执行：Monitors→AutoZeroUV→Execute。上样操作方式两种方式同一原则：防气泡、防污染、上样完全后再切换阀位环样品环上样（常用，小体积）体积注射器吸取样品，体积须超过样品环体积缓慢注入从进样阀Load口缓慢注入，注完后不要立即拔出注射器切换Inject将阀切至Inject启动上样，结束后切回Load清洗用纯水清洗上样环至少3次泵泵上样（大体积）样品连接样品管接入样品泵入口自动上样在方法中设置上样体积与流速自动上样洗脱与收集梯

度洗脱参数设定：TargetB100%、Length10CV、检测波长280nm，A液到B液线性或阶梯梯度。梯度方式：A液到B液·线性或阶梯梯度100%TargetB10CVLength280nm检测波长固定体积收集按体积收集管类型与体积设定收集管类型与每管体积自动收集系统自动按体积收集，无需人工干预峰收集按UV阈值UV阈值触发设定UV阈值，信号高于阈值时触发收集自动收集目标峰自动收集目标峰，精准捕获目的蛋白实验结束的清洗与保存实验结束后按顺序完成系统清洗与保存，关机前依次执行EndRun→Disconnect→Exit，再关闭仪器与电脑电源。核心：系统流路清洗纯水冲洗

≥30min，再以

20%乙醇

冲洗

≥30min清洗完成后按序退出软件并关机清洗与保存要点层析柱长期不用应保存在

20%乙醇

中泵头管路浸泡于

20%乙醇

中保存进样口与收集器擦拭清洁，清理残留盐结晶废液瓶及时倾倒废液各部位处理方式系统流路纯水冲洗

≥30min，再以

20%乙醇

冲洗

≥30min层析柱长期不用保存在

20%乙醇

中泵头管路浸泡于

20%乙醇

中保存进样口与收集器擦拭清洁，清理残留盐结晶废液瓶及时倾倒废液CHAPTER风险防控防患于未然，胜过事后补救注意事项与日常维护保养要点03操作安全红线这些红线对应的都是最易损坏仪器的误操作，新员工须牢记防高压严禁洗泵时连接层析柱——高压会损坏填料防倒吸抽滤完毕须等真空泵压强降为零再打开，防止液体倒吸限压设置柱前报警压须计入限流器的

0.2MPa

反压防空气样品注入后注射器不可立即拔出，防止空气进入流路降压柱子限压在0.3MPa以下时，可将Restrictor切至By-pass状态降低反压分级维护保养计划AKTA系统维护按周期分级执行，定期维护是延长设备寿命、保证结果稳定的关键。维护周期核心维护内容每日使用后纯水冲洗，检查润洗液20%乙醇流动正常每周更换泵后润洗液，检查管道通畅与压力零点每月检查反压阀压力（10mL/min差值为

0.2±0.05MPa），1MNaOH清洗流路每半年清洗紫外流通池，检查pH电极斜率每年联系供应商预防性保养，更换易损耗材AKTA系统维护按周期分级执行，定期维护是延长设备寿命、保证结果稳定的关键。pH电极与日常收尾收尾动作完整，才能让下一位使用者顺利接续。pH电极保养使用前需校正，无需拆下电极，从校正口注入即可保存时浸泡在

保护液（pH4buffer与1MKNO₃按1:1混合）中校正斜率低于

80%

时需清洗或更换电极日常收尾废液出口须高于液面，不得插入液体清理桌面、擦拭仪器表面溢出液与结晶盐完成使用登记，填写实验记录CHAPTER故障应对遇事不慌，按序排查常见问题定位与处理方法04压力异常的排查思路压力升高

不等于

层析柱堵塞，盲目反向冲柱可能损伤柱体与填料。按序排查1先确认报警压设置是否正确，是否计入限流器反压2检查管路连接是否漏液3检查在线滤膜是否堵塞4最后再考虑柱子问题压力定位依据系统泵后、样品泵后、柱前、柱后均设有压力传感器柱前压

代表柱硬件受压柱前后压差

代表填料受压，应分别观察定位问题气泡与pH异常处理共同排查原则：先排除系统因素，再排查部件。01问题现象气泡问题表现为涡流、基线噪声、压力不规则检查储槽洗脱液是否充足检查所有管路连接是否泄漏打开Purge低速冲洗排出气泡02异常处理pH异常处理pH不稳定：先无柱无样运行排查系统，再检查混合体积、泵操作、pH电极是否脏污或破损pH漂移：将注入阀切至WASTE，泵入至少

30mL

缓冲液稳定后返