CN119452078A Ipsc来源的星形胶质细胞及其使用方法 （富士胶片控股美国公司）

2024.12.27PCT/US2023/0693772023.06.29WO2024/006911EN2024.01.04本公开提供了从诱导多能细胞产生具有神经胶质偏好性的神经前体细胞并进一步将神经步提供了使用星形胶质细胞进行筛选测定的方2(b)在至少一种白血病抑制因子(LIF)受体配体存在下培养NPC足够产生星形胶质细胞(c)在至少一种LIF受体配体和脂质浓缩物存在下进一步培养APC足够产生星形胶质细10.根据权利要求8所述的方法，其中，ECM蛋白337.根据权利要求1～35之任一项所述的方法，其中，星形胶质细胞是CD44、S100b、38.根据权利要求1～35之任一项所述的方法，其中，星形胶质细胞呈SSEA4和CD44阳39.根据权利要求1～35之任一项所述的方法，其中，至少30％的星形胶质细胞群呈40.根据权利要求37所述的方法，其中，星形胶质细胞具有功能42.根据权利要求1～41之任一项所述的方法，其中，步骤(b)还包括在脂质浓缩物、452.根据权利要求1～51之任一项所述的方法，其中55.根据权利要求1～54之任一项所述的方61.根据权利要求1～60之任一项所述的方法，其中，星形胶质细胞群至少80％呈62.根据权利要求1～61之任一项所述的方法，其中，星形63.根据权利要求1～62之任一项所述的方法，其566.药物组合物，其包含根据权利要求1～63之67.根据权利要求66所述的组合物，其中，星形胶质细胞群68.根据权利要求66所述的组合物，其中，星形胶质细胞群71.根据权利要求69所述的组合物，其中，星形胶质72.根据权利要求69所述的组合物，其中，星形胶质74.用于筛选测试化合物的方法，其包括将测试化合物导入权利要求66～73之任一项76.根据权利要求66～73之任一项所述的组合物作为神经退行性疾病或损伤的模型的77.共培养物，其包含通过权利要求1～63之任一项所述的方法产生的星形胶质细胞78.根据权利要求77所述的共培养物用于模79.试剂盒，其包含通过根据权利要求1～63之任一项所述的方法产生的星形胶质细82.治疗神经退行性疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的根据权利要求66～736[0002]本申请要求2022年6月29日提交的美国临时申请序列号63/356,787的优先权，其形胶质细胞增生)。这些反应性星形胶质细胞在许多神经系统疾病的发生和发展中发挥作[0008]本公开的某些实施方式提供了一种用于从诱导多能干细胞(iPSC)产生星形胶质种白血病抑制因子(LIF)受体配体存在下培养NPC足够产生星形胶质细胞祖细胞(APC)的时间；(c)在至少一种LIF受体配体和脂质浓缩物存在下进一步培养APC足够产生星形胶质细[0010]在某些方面，获得NPC的起始群包括：(a)在ROCK抑制剂存在下，在细胞外基质78[0024]另一个实施方式提供了本实施方式或其方面的组合物作为神经退行性疾病或损[0030]以下附图构成本说明书的一部分，并被包括在内以进一步演示本发明的某些方~2D)进行细胞内抗原染色。多能性标志物SSEA_4和TRA_1_60在14天的分化过程中显著降960天接种在PLO/层粘连蛋白基质(B顶部)上的细胞的相差图像，以及分化后第35天和第80成熟星形胶质细胞的功能标志物。CD15和SSEA4的低表达表明在培养物中不再观察到多能具有成本效益。(图3E)时程谷氨酸摄取效率。在基质胶上接种96孔板7天后进行谷氨酸摄BrainPhys培养基中单独培养或与20000iCell星形胶质细胞或NPC星形胶质细胞共培养23GlutaNeuron单一培养相比，在含有iCell星形胶质细胞或NPC星形胶质细胞的共培养物中络形成的影响。外源性谷氨酸的额外应用足以阻止iCellGlutaNeuron单一培养物中的所定在此过程中D35时具有增殖和星形胶质细胞祖细胞标志物表达的最佳组合，如图4所示。在所有条件下都可以观察到星形胶质细胞系标志物NFIX的几乎均匀表达(＞90％的细胞在除培养基18之外的所有培养基条件下表达NFIX)，以及缺乏多能性标志物SSEA4(在所有培CD15(CD15的表达在所有条件下都低于5％)。可以清楚地看到某些条件上调星形胶质细胞此在指定NPC细胞的星形胶质细胞系方面最有效。(图5B)11种培养基基质在35天分化中的在使用培养基3分化的细胞中观察到很少的GFAP。(图5D)来自5培养基比较研究的D49细胞条件下在D28表面CD56/SSEA4共染色和在D28和D35细胞内CD44/SSEA4共染色的代表性流式细胞术图。证明了共表达星形胶质细胞标志物CD44和SSEA4(多能细胞的经典标志物)的细条件29。在D35后，可以在从培养基条件14、16和24分化的星形胶质细胞中观察到CD44和件29或使用培养基3分化的对照细胞中未观察到这种情况。培养基条件14、16和24继续到培养基中培养的解冻后7天的星形胶质细胞免疫细胞化学。解冻后使用的所有培养基同样[0038]图8A～8J：将来自四个批次的星形胶质细胞解冻并在Astro分泌增加400倍以上。与对照组相比，TNF_α与IL_1α或IL_1β联合使用使IL_6分泌增加了细胞(OPC)的募集和分化中发挥作用，以促进髓鞘再生。(图8D)星形胶质细胞在用IL_1α、联合使用可使CCL5/RANTES分泌增加2500倍以上。CCL5/RANTES控制外周免疫细胞的运动。IL_1α或IL_1β联合使CCL7分泌增加了15,000倍以上。CCL7对星形胶质细胞_小胶质细胞相以上。与对照组相比，TNF_α与IL_1α、IL_1β或IFN_γ联合CCL20分泌增加了100倍以上。可以成功冷冻保存并用于多细胞检测特异性应用、临床前应用或冷冻保存前或后临床应这些方法和组合物的基本和新颖特性产生实质性影定组分的总量远低于0.05最好低于0.01％。最优选的成分能处于风险和/或易感性的受试者或患者中疾病的病理或症状的发作但尚未经历或显示疾2007)通过导入与多能性相关的转录因子对体细胞进行重编程。多能干细胞可以维持在未分化的祖细胞(包括体细胞干细胞)和最后分化的成熟细胞也可以用作本文公开的方法中[0066]主要组织相容性复合体(MHC)是同种异体器官移植免疫排斥反应的主要原因。有[0070]可以使用任何本领域技术人员已知的方法对体细胞进行重编程以产生诱导多能Lin28b或编码Lin28或Lin28b的核酸可用作额外的核重编程物质。Nanog也可用于核重编一步包括将细胞与一种或多种信号传导受体接触，包括糖原合成酶激酶3(GSK_3)抑制剂、[0072]这些核重编程物质的小鼠和人cDNA序列可以参考WO2007/069666中提到的NCBI些重编程物质的核酸的方法在本领域是已知的，例如在已公布的美国专利申请号2012/或暴露于成纤维细胞饲养层细胞的培养基上培养多能细胞，以将干细胞维持在未分化状可以使用的自杀基因/前药组合的例子是截短的EGFR和西妥昔单抗；单纯疱疹病毒胸苷激根过氧化物酶或碱性磷酸酶或萤火虫/海肾荧光素酶或nanoluc)或其他蛋白。标志物可以656,610、5,589,466和5,580,859，均作为引用并入本文)，包括显微注射(Harland和用DEAE_葡聚糖，然后是聚乙二醇(Gopal，1985年)；通过直接声波加载(Fechheimeret含具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体在本领域是众所周知的(例如，参见[0089]使用基于质粒或脂质体的染色体外(即游离)载体也可以在本公开的某些方面提胞免疫反应，因为它已经开发出一种有效的机制来绕过在MHCI类分子上呈递其抗原所需的包括或Epstein_Barr病毒(EBV)可能会在染色体外复制并帮助将重编程基因递送到体细[0093]任何本领域技术人员将能够很好地通过标准重组技术构建载体(例如参见[0094]载体还可以包含进一步调节基因递送和/或基因表达的其他组分或功能，或以其[0097]在本公开中有用的重编程载体中包含的表达盒优操作地连接到蛋白编码序列的真核转录启动子、包括中间序列的剪接信号和转录终止/聚腺苷酸化序列。启动子刺激DNA的转录并促进编码的RN激活的顺式作用调节序列。[0101]启动子可以是与核酸序列天然结合的启动子，如可以通过分离位于编码片段和/启动子和增强子的核酸序列外，还可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)与本文公开的组合物相关来产生序列(参见美国专利号4,683,20的控制序列。体中的表达的启动子和/或增强子将是很重要的。那些精通分子生物学领域的人通常知道[0104]非限制性实例启动子包括早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子、例如β肌动蛋白启动子(Ng，1989；Quitsche等人，1989)，GADPH启动子(Alexander等人，体可以访问每个开放的阅读框以进行高效翻译。使用单个启动子/增强子可以有效地表达制病毒的复制起点或自主复制序列(ARS)。纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域的技术人员还将知道如何使酸酶，包括DNA结合靶向核酸酶，如锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应核酸酶[0120]在一些实施方式中，基因破坏是通过诱导基因中的一个或多个双链断裂和/或一短干扰RNA(siRNA)、短发夹(shRNA)和/或核酶被用来选择性地抑制或抑制基因的表达。多顺反子构建体组成。在特定方面，siRNA抑制来自内源性mRNA的野生型和突变型蛋白翻子样蛋白(TAL)或TAL效应子(TALE)DNA结合结构域、成簇的规则间隔短回文重复序列识别螺旋区进行工程改造(改变一个或多个氨基酸)。工程化D016536和WO03/016496以及美国公布号2011/030特异性DNA切割分子(如核酸酶)融合或与之复合的序列特异性DNA或单链断裂来进行精确的基因修饰，刺激细胞DNA修复机制，包括易错的非同源末端连接[0129]在一些实施方式中，DNA靶向分子包括DNA结合蛋白，例如一个或多个锌指蛋白[0132]在某些方面，MeCP2的破坏是通过将基因中的第一靶位点与第一ZFP接触来进行[0133]在一些实施方式中，进一步接触的步骤包括将基因中的第二目标位点与第二ZFP国加利福尼亚州里士满)与Sigma_Aldrich(美国密苏里州圣路易斯)合作开发了一个用于[0141]在一些实施方式中，DNA靶向分子包含天然存在或工程化(非天然存在)的转录激[0142]TALEDNA结合结构域或TALE是包含一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。重常位于重复序列的第12位和/或第13位。已经确定了这些TALE的DNA识别的天然(规范)密导致双链断裂。在某些方面，断裂刺激同源重组或非同源末端连接(NHEJ)的速率。通常，18,740个人蛋白编码基因的TALEN文库。定制设计的TALE阵列可通过CellectisLifeTechnologies(美国纽约州格兰德岛些方面，质粒载体可以包含一个选择标记，用于识别和/或选择接收所述载体的细胞。因表达或指导其活性的转录本和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活[0148]CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统可以包括非编码RN[0149]在某些方面，将Cas核酸酶和gRNA(包括对靶序列特异性的crRNA和固定tracrRNA的融合)导入细胞中。通常，gRNA5'端的靶位点使用互补碱基配对将Cas核酸酶靶向少一部分杂交到tracr伴侣序列(可操作地链接到导向序列)的所有或部分。tracr序列与个或多个元件可以组合到单个载体中，一个或多个附加载体提供CRISPR系统的任何组分，[0154]载体可以包含可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列的调节元件，例如Cas本。这些酶是已知的；例如，酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9蛋白的氨基酸序列可以在[0155]所述CRISPR酶可以是Cas9(例如，来自酿脓链球菌(S.pyogenes)或肺炎链球菌如，来自酿脓链球菌(S.pyogenes)的Cas9的RuvCI催化结构域中的天冬氨酸_丙氨酸取代[0156]在一些实施方式中，编码CRISPR酶的酶编码序列被优化为在特定细胞(例如真核细胞)中的表达而优化的密码子。真核细胞可以是来子替换为该宿主细胞基因中更频繁或最常用的密码子来修饰核酸序列以增强目标宿主细差(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA(mRNA)的翻译效率又被认为取决于被翻译密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用[0158]可以使用任何合适的算法来确定最佳比对序列，其非限制性示例包括Smith_Waterman算法、Needleman_Wunsch算法、基于Burrows_Wheel融合蛋白可以包含任何其他蛋白序列，以及任意两个结构域之间的可选接头序列。可与浮液中产生分化细胞的方法。在一些实施方式中，将PSC培养至预汇合以防止任何细胞聚[0162]一旦在已知细胞密度下获得PSC的单细胞悬浮液，通常将细胞接种在适当的培养的体积至少或约为[0165]细胞外基质(ECM)蛋白可以是天然来源的并从人或动物组织中纯化的，或者，或机盐。示例性生长培养基包含最低必需培养基，例如Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)或细胞生长。最低必需培养基的示例包括但不限于最低必需培养基Eagle(MEM)α培养基、获得更多便利。市售材料包括KNOCKOUTTM血清替代物(KSR)、化学成分确定的脂质浓缩物％或其中可推导出的任何范围。[0171]iPSC、NPC和/或星形胶质细胞可以在成分确定的培养基中培养，包括但不限于[0173]iPSC可以分化为具有神经胶质偏倚的NPC，也称为神经胶质祖细胞。iPSC可以用[0175]然后可以用TrypLE(Gibco)解离细胞，并使用包含必需6(Gibco)、N2补充剂可以在超低吸附量瓶、旋转器(例如500mL)或生物反应器(例如PBS微型生物反应器)中形[0176]可以对细胞进行多能性标志物SSEA_4和TRA_1_60以及NPC标志物的染色，例如[0179]用于从NPC产生星形胶质细胞的示例性分化程序示意图如图3A所示。NPC可以以个或多个LIF受体配体，例如白血病抑制因子蛋白(LIF)、睫状来源神经营养因子蛋白组织特异性标志物表达是对照细胞(例如未分化多能干细胞或其他不相关的细胞类型)的剂和无机盐。示例性生长培养基包含最低必需培养基，例如Dulbecco改良Eagle培养基以促进干细胞生长。最低必需培养基的示例包括但不限于最低必需培养基Eagle(MEM)α培代品可以包括适当含有白蛋白的材料(如富含市售材料包括KNOCKOUTTM血清替代物(KSR)、化学成分确定的脂质浓缩物(Gibco)和％或其中可推导出的任何范围。[0190]通过本文公开的方法产生的细胞可以被冷冻保存，例如参见PCT公开No.2012/存温度范围为约50℃~约60℃、约60℃~约70℃、约70℃~约80℃、约80℃~约90温保存温度约为80℃~约180℃,或约125℃~约140℃。在一些实施方式中，将细胞冷以使用控速冰箱进行冻存。冻存细胞可以在约25℃~约40℃的温度下解冻，通常通常在约37℃的温度下解冻。[0194]本公开提供了一种可以产生NPC和星形胶质细胞的方法。这些细胞群可用于许多[0196]通过本文公开的方法产生的细胞系可用于目前已知的iPSC或分化细胞的任何方生影响的化合物可能对这种组织类型的细胞产生意想不到[0203]适用的疾病包括但不限于自闭症、RETT综合征、精神分裂症、脆性X综合征、[0207]如本文所述的药物组合物和制剂可以通过将具有所需纯度的活性成分(例如细胞)以冻干制剂或水溶液的形式与一种或多种可选的药学可接受的载体混合来制备[0214]用EDTA收获人诱导多能干细胞(hiPSC)，在含有1μMROCK抑制剂H1152(Sigma)的Essential8培养基(Gibco)中以15,000c/cm2的基质胶(Corning)包被的组织培养物(TC)处理的平板上接种，并在低氧条件下培养。在第1天去除ROCK抑制剂，并给细胞补给聚集体培养8天，每隔一天用不含H1152的NPC分化培养基补给。第14天，在37℃水浴中用TrypLE解离聚集体10～15分钟。将解离的细胞过滤100μM，并使用CryoStorCS10色10分钟，然后用4％甲醛(Sigma)固定15分钟。用0.1％triton(Sigma)或0.1％皂苷(MPBiomedicals)透化细胞，并用抗体稀释液染色过夜。使用AccuriC6流式细胞仪(BD[0216]从NPC产生星形胶质细胞的分化程序示意图如图3A所示。将NPC以20k/cm2的密度10分钟，并在MolecularDevicesImageXpress自动显微镜上成像。第60天细胞接种在PLO/层粘连蛋白基质(B顶部)上的相差图像以及分化后第35天和第80天星形胶质细胞标志TBOA样品中谷氨酸浓度占相应+TBOA样品的百分比)如图3E所示。NPC来源的星形胶质细胞[0218]谷氨酸施用之前(基线)和之后不同培养物的微电极测定(MEA)光栅图如图3F所元共培养的电活性与MEA上的神经元单一培养进行了比较。简而言之，在48个经典MEA板(AxionBiosystems)上，将120K的iCellGluta神经元与30K的iCell星形胶质细胞或NPC_细胞共培养和iCellGluta神经元与NPC衍生星形胶质细胞共培养)的4个孔中，并在1小时种培养基基质在分化35天内的累积倍数扩展分析如图5C所示。条件14显示约28倍的扩展，评估5种培养基基质(图5E)(图5E)。然14条件下，D28上表面CD56/SSEA4共染色和D28和D35上细胞内CD44/SSEA4共染色的代表性从第14天的约40％逐渐增加到第35天的80％以上。测量D28和D35表面和细胞内染色的件29的表达谱摘要。对于条件14、16和24，第28天的SSEA4阳性细胞超过60第35天的[0222]解冻后7天的星形胶质细胞在Astro3培养基、AMM或BrainPhys完全培养基中培养[0223]为了进一步评价衍生的星形胶质细胞的功能，将星形胶质细胞_神经元共培养的电活性与MEA上的神经元单一培养的电活性进行了比较。常见星形胶质细胞分泌蛋白浓度的Luminex分析如图7D所示。细胞因子或LPS诱导的反应性星形胶质细胞分泌蛋白浓度的IL_1α或IL_1β联合导致比未刺激的对照增加约1[0228]星形胶质细胞在用IL_1α、TNF_α或其组合刺激后能够稳健分泌IL_8/CXCL8(图[0231]星形胶质细胞在用IL_1α、TNF_α或其组合刺激后能够稳健地分泌CCL7(图8F)。α单独或与IFN_γ联合使用导致CXCL2α单独或与IFN_γ联合使用导致CXCL5培养基1培养基2培养基3培养基4培养基5培养基6培养基7培养基8基础M基础M基础M基础M基础M基础M基础M基础M脂质浓缩物脂质浓缩物脂质浓缩物脂质浓缩物CT1CT1CT1CT1EGFEGFEGFEGF培养基25培养基26培养基27培养基28培养基29培养基30培养基31基础M基础M基础M基础M基础M基础M基础MDLL1DLL1DLL1DLL1DLL1DLL1DLL1JAGG1JAGG1JAGG1JAGG1JAGG1JAGG1JAGG1脂质浓缩物脂质浓缩物脂质浓缩物CT1CT1CT1CT1EGFEGFEGFEGF有此类类似的替代物和修改均被视为符合所附权利要求所定义的发明的精神、范围和概[0253]Alexanderet[0254]Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePubl.Assoc.Inc.&JohnWiley&Sons,Inc.,MA,1996.[0255]Blomeretal.,1997.[0256]Chenetal.,NatureMethods8:424_429,2011.[0257]Ercolanietal.,J.Biol.Chem.,263:15335_15341,1988.[0258]Evans,etal.,In:CancerPrinciplesandPracticeofOncology,Devitaetal.(Eds.),Lippincot_Raven,N[0259]Fechheimeret[0270]Karinetal.Cell,36:371_379,1989.[0271]Langle_Rouaultetal.,J.Virol.,72(7):6181_6185,1998.[0272]Levitskayaetal.,Pr[0273]Ludwigetal.,Nat.Biotechnol.,24:18[0275]Maniatis,etal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1988.[0276]Ng,Nuc.AcidRes.,17:601_615,1989.[0277]PelletierandSonenberg,Nature,334(6180):320_325,1988.[0278]Quitscheetal.,J.Biol.Chem.,264:9539_9545,1989.[0279]Richardsetal.,Cell,37:263_272,1984.[0280]SambrookandRussell,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rd[0281]Takahashietal.,Cell,131:861872,2007.