【《可视LAMP-浊度技术检测金黄色葡萄球菌方法的建立分析概述》3800字】

[69]。本章研究中，通过设计金黄色葡萄球菌编码胞浆蛋白质的保守基因femA序列特异性LAMP引物，建立金黄色葡萄球菌快速检测的可视LAMP-浊度体系，本研究采用日本荣研研发的LT-16alpha恒温扩增基因检测系统（浊度仪），进行LAMP反应的扩增和结果待检测。探讨可视LAMP-浊度技术的最适反应温度，并且分析可视LAMP-浊度技术检测金黄色葡萄球菌的灵敏度与特异性。期望可视LAMP-浊度技术的建立能够金黄色葡萄球菌快速检测工作提供一条新途径。1.2.材料与方法1.2.1材料与仪器（1）菌株：试验中所用菌株名称和编号如表3-1所示。表3-1菌株及编号Table3-1strainandnumber菌株名称编号来源金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌

ATCC6538

CICC10201

北京陆桥技术有限责任公司中国工业微生物菌种保藏管理中心宋氏志贺氏菌CICC21679

中国工业微生物菌种保藏管理中心甲型副伤寒沙门氏菌CICC50084中国工业微生物菌种保藏管理中心鼠伤寒沙门氏菌ATCC10428北京陆桥技术有限责任公司单增李斯特菌ATCC19115北京陆桥技术有限责任公司致病性大肠埃希氏菌CICC10372

中国工业微生物菌种保藏管理中心阪崎肠杆菌CICC21560中国工业微生物菌种保藏管理中心以上所有菌种分别接种于在营养琼脂培养基上，将接种好菌株的培养基存放在4℃冰箱中与之备用。在需要进行试验时取出菌种，经过两次传代培养后，用接种环挑去出形态典型的单个菌落，接种在LB培养基中，在37℃、120rmp离心，振荡培养18h-24h后，用无菌生理盐水中做稀释,放置备用。（2）仪器与设备：试验中所用仪器设备和产品编号如表3-2所示。表3-2仪器设备及产品编号Table3-2equipmentandproductnumber名称来源LT-16alpha恒温扩增基因检测系统荣研生物科技（中国）有限公司OptiGene便携式基因荧光扩增仪北京晟泰勃科技有限公司Bio-rad

ChemiDocXRS+凝胶成像系统AppliedBiosystemsVeriti96-WellPCR扩增仪DYY-12型电泳仪DL-CJ-1N超净工作台电热恒温水浴锅SP-150B-Z生化培养箱TGL-16B台式高速离心机上海艾研生物科技有限公司北京佳源兴业科技有限公司北京六一生物科技有限公司河南信陵仪器设备有限公司无锡玛瑞特科技有限公司

常州诺基仪器有限公司上海习仁科学仪器有限公司桌面离心机上海生工生物工程技术服务有限公司CRY-2102C恒温振荡器麦科仪(北京)科技有限公司BS124S电子分析天平北京塞多利斯仪器系统公司ZDX-35SBI高压蒸汽灭菌锅山东博科消毒设备有限公司微量移液器(0.5～10µL;10～100µL）济南欧莱博电子商务有限公司试剂：基因组DNA提试剂盒（柱式法）（产品批号B518225）购自上海生工生物工程技术服务有限公司；Bst聚合酶（产品批号5Z006）购自中国荣研生物科技有限公司；2×TaqPCRMasterMix（产品批号P4218）、DL1000DNAMaker（产品编号3591A）购自天根生化科技（北京）有限公司；IsothernalMasterMix购自北京晟泰勃科技有限公司；均由北京市路桥技术有限公司提供各种细菌培养基。其他试剂同第二章2.2.1材料与方法中所示进行配置。1.2.2细菌DNA模板的提取研究所用所有菌株的DNA模板提取均按照上海生物工程有限公司DNA提取试剂盒（细菌）的说明书进行操作提取，详细操作同2.2.2所述。1.2.3可视LAMP-浊度技术引物的设计根据GenBank上公布的金黄色葡萄球菌的femA保守基因序列，通过Primer

explore

version在线软件设计出一套特异性引物，分别是：正向外引物（F3）、反向外引物（B3）、正向内因物（FIP）、反向内因物（BIP），引物序列如表3-3，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。表3-3

金黄色葡萄球菌LAMP引物序列Table3-3primersequenceofStaphylococcusaureusLAMP引物序列（5'-3'）F3TCTCTTTATTGGGAGCAATCA

B3TTAAATGTTGTCGTGTCTTCAFIP

GACATCGGGATTAGCAGAAATCAACCCTTCGCATACTTTTTCAGA

CCCCCCCGCCGCAGAGA

BIPAGTGACAGCAAATGACCTCCGCAGGGAGAACCAGTCCGTAAATAA

1.2.4可视LAMP-浊度技术反应体系和PCR反应体系(1)可视LAMP-浊度反应体系可视LAMP-浊度反应体系为25μL：12.5μL的2×ReactionMIX（包括40mmol/L的Tris-HCL，10mmol/L的KCl，16mmol/L的MgSO4，20mmol/L的(NH4)2SO4，Tween200.2%，1.6mmol/L的Betaine，2.8mmol/L的dNTPs），BstDNA聚合酶DNA1μL，5pmolF3和B3引物各1μL，40pmolFIP和BIP引物各1μL，DNA模板2μL，最后补足体系至25μL用灭菌双蒸水进行；进行1h反应。(2)PCR反应体系同样为了比较可视LAMP-浊度技术检测金葡菌灵敏度，进行了PCR反应，PCR扩增体系20μL：10μL的2×Taq

PCR

Master

Mix、1μL的F3引物、1μL的B3引物和1μL的模板，最后用灭菌双蒸水补足体系至20μL，58℃为退火温度。1.2.5可视LAMP-浊度技术反应体系温度优化本研究利用日本荣研LT-16alpha恒温（浊度）扩增基因检测系统进行浊度信号监测，将反应温度作为主要优化对象。设计梯度温度依次为60.0℃，61.0℃，62.0℃，61.0℃，64.0℃，5个温度，分别扩增30min观察出峰时间，确定LAMP-浊度扩增方法最佳反应温度。1.2.6可视

LAMP-浊度技术特异性分析

本研究用表3-1中2株金黄色葡萄球菌（ATCC6538、CICC10201

）和6株非金黄色葡萄球菌来验证可视LAMP-浊度技术的特异性。按照上DNA提取试剂盒（细菌）说明书先复苏培养所有菌株并按照操作说明提取金黄色葡萄球菌、宋氏志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、致病性大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌的核酸，分别作为模板用建立的可视LAMP-浊度技术进行扩增，从而检测验证其LAMP浊度技术的特异性。1.2.7可视

LAMP-浊度技术灵敏度分析将前一天培养好的新鲜菌液，隔天取出，并且使用无菌生理盐水进行10倍数的系列进行稀释，并且在每个浓度梯度里取1mL菌液进行DNA基因的提取并依此作为模板，利用建立的可视LAMP-浊度体系进行反应扩增和检测结果，从而确定菌液灵敏度。可视LAMP-浊度反应体系为25μL：12.5μL的2×ReactionMIX（包括40mmol/L的Tris-HCL，10mmol/L的KCl，16mmol/L的MgSO4，20mmol/L的(NH4)2SO4，Tween200.2%，1.6mmol/L的Betaine，2.8mmol/L的dNTPs），BstDNA聚合酶DNA1μL，5pmolF3和B3引物各1μL，40pmolFIP和BIP引物各1μL，DNA模板2μL，最后补足体系至25μL用灭菌双蒸水进行；进行1h反应。1.3结果与分析1.1.1反应温度的优化利用日本荣研LT-16alpha恒温（浊度）扩增基因检测系统该反应曲线的出峰时间作为评价的指标进行浊度信号监测。依据本研究关于反应温度的优化设计，反应温度依次为60.0℃，61.0℃，62.0℃，61.0℃，64.0℃，5个温度，分别扩增30min时均有扩增，金黄色葡萄球菌出现扩增，浊度明细上升，如图3-1，图3-2，图3-3，图3-4，图3-5所示，Tm值如表3-4所示。图3-1LAMP-浊度扩增60℃出峰图Fig.3-1LAMPturbidityamplificationpeakat60℃图3-2LAMP-浊度扩增61℃出峰图Fig.3-2LAMPturbidityamplificationpeakat61℃图3-3LAMP-浊度扩增62℃出峰图Fig.3-3LAMPturbidityamplificationpeakat62℃图3-4LAMP-浊度扩增63℃出峰图Fig.3-4LAMPturbidityamplificationpeakat63℃图3-5LAMP-浊度扩增64℃出峰图Fig.3-5LAMPturbidityamplificationpeakat64℃表3-4LAMP-浊度扩增不同温度Tm/Df值Table3-4Tm/DfvaluesofLAMPturbidityamplificationatdifferenttemperatures温度℃Tm值（min）Df值6017：5515406120：0615906219：2818886316：0924106420：011546由上述图表可知，63℃时最早出现峰值（图3-4），Tm值为16：09，结果表明可视LAMP-浊度技术方法最佳反应温度应控制在63℃。1.1.2可视

LAMP-浊度技术特异性分析依据本研究关于可视LAMP-浊度技术特异性分析的设计，用表3-1中2株金黄色葡萄球菌菌株（ATCC6538、CICC10201

）和宋氏志贺氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、致病性大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌6株非金黄色葡萄球菌菌株的DNA作为特异性分析模板，进行扩增。观测反应结果，如表3-5、如图3-6所示。表3-5LAMP-浊度的特异性试验Tm/Df值Table3-5specificanalysistestsamplesandtestresults菌株名称编号Tm值（min）Df值金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌

ATCC6538

CICC10201

17：0818：121680990宋氏志贺氏菌CICC21679

甲型副伤寒沙门氏菌CICC50084鼠伤寒沙门氏菌ATCC10428单增李斯特菌ATCC19115致病性大肠埃希氏菌CICC10372

阪崎肠杆菌CICC21560图3-6LAMP-浊度特异性试验扩增曲线Fig.3-6amplificationcurveofLAMPturbidityspecifictest由上图可见，发现2株金黄色葡萄球菌均进行扩增，浊度微分值明显上升，出现浊度曲线；而6株非金黄色葡萄球菌均未发生反应，未出现明显峰值。结果表明，本研究建立的可视LAMP-浊度技术检测金黄色葡萄球菌具有良好的特异性。1.1.3可视

LAMP-荧光技术灵敏度分析依据本研究关于可视LAMP-浊度技术灵敏度分析的设计，与可视LAMP-荧光技术灵敏度分析时菌液浓度保持一致，采用浓度为8.7×106cfu/mL金黄色葡萄球菌液培养物，对原液进行倍比稀释，浓度依次为8.7×105cfu/mL，8.7×104cfu/mL，8.7×103cfu/mL，8.7×102cfu/mL，8.7×100cfu/mL，8.7×101cfu/mL，8.7×10-1cfu/mL，以各浓度梯度的金黄色葡萄球菌DNA作为模板进行可视LAMP-浊度技术对金黄色葡萄球菌纯培养物的灵敏度检测，检测结果如图3-7、表3-6所示。图3-7LAMP-浊度灵敏度试验扩增曲线Fig.3-7amplificationcurveofLAMPturbiditysensitivitytest表3-6LAMP-浊度灵敏度试验Tm/Df值Table3-6Tm/DfvalueofLAMPturbiditysensitivitytest不同菌液浓度Tm值（min）Df值8.7×10517：2520088.7×10419：4820548.7×10320：2915598.7×10223：0416728.7×10127：1215128.7×1008.7×10-1阴性对照由上图表可见，阴性对照无扩增，当金黄色葡萄球菌菌液浓度为8.7cfu/mL时，曲线无特异性扩增；当金黄色葡萄球菌菌液浓度为8.7×101cfu/mL时，曲线出现特异性扩增，27min左右出现峰值，Tm/Df值为27：12；当金黄色葡萄球菌菌液浓度为8.7×102cfu/mL及以上时，曲线均有特异性扩增，且峰值出现的时间越来越早。结果表明，本研究建立的可视LAMP-浊度技术检测金黄色葡萄球菌的灵敏度为87cfu/mL。图3-8PCR灵敏度电泳分析图Fig.3-8electrophoreticanalysisofPCRsensitivityMD