CN119487185A 筛选植物功能增益突变的方法及其组合物 （加利福尼亚大学董事会）

2024.12.11PCT/US2023/0656332023.04.11WO2023/201230EN2023.10.19本公开涉及筛选靶基因的非编码区中的功括光系统II亚基S(PsbS)、玉米黄质环氧化酶涉及通过在靶基因的非编码区中引入功能增益及通过该方法产生的改良经济作物植物或作物2(a)使用靶向靶基因的一种或多种RNA引导的核酸修饰酶在植物的植物细胞群的靶基3.根据权利要求1或2所述的方法，其中一种或多种RNA引导的核酸修饰酶由包含可选选包括通过叶绿素荧光筛选后代植物以鉴定对于突变而言推定为纯合的无转基并且步骤(c)(2)的筛选包括通过叶绿素荧光筛选后代植物以鉴定对于突变而言推定为纯11.根据权利要求1_10中任一项所述的方法，其中与在相同条件下生长的缺乏功能增15.根据权利要求1_14中任一项所述的方法，其中引导RNA靶向靶基因中的至少一个16.根据权利要求1_15中任一项所述的方法，其中至少50％的突变组位于选自以下的319.根据权利要求1_18中任一项所述的方法，其中在每种情况下与在相同条件下生长的缺乏功能增益突变的植物相比，功能增益突变为靶基因转录的增加、由靶基因产生的20.根据权利要求1_19中任一项所述的方法，其中高粱)植物、大豆(Glycinemax)植物、豇豆(Vignaunguiculata)植物、杨树(Populusvulgare)植物、马铃薯(Solanumtuberosum)植物、甘蔗(Saccharumspp.)植物、苜蓿23.根据权利要求22所述的方法，其中植物是水稻(Oryzasativa)植物、玉米(Zeamays)植物或豇豆(Vignaunguiculata)25.根据权利要求1_24中任一项所述的方法，其中靶基因选4因包含选自由SEQIDNO:92和SE30.根据权利要求27所述的方法，其中一种或多种不同的引导NO:89或SEQIDNO:90的间隔序列。31.根据权利要求28所述的方法，其中一种或多种不同的引导NO:36或SEQIDNO:37的间隔序列。32.根据权利要求29所述的方法，其中一种或多种不同的引导33.根据权利要求30_32中任一项所述的方法，其中一种或多种不同的引导RNA使用载体引入，并且其中载体包括包含SEQIDNO:9的两种或更多种gR(b)将权利要求1_33中任一项所述的方法中鉴定的功能增益突变引入到经济作物植物米(Zeamays)植物或豇豆(Vignaunguiculat36.一种包含靶基因的非编码序列中的功能增益突变的改良经济作物植物或作物种37.根据权利要求36所述的改良经济作物植物或作物种子，其中经济作物植物包括水38.根据权利要求36或权利要求37所述的改良经济作物植物或作物种子，其中靶基因选自光系统II亚基S(PsbS)基因、玉米黄质环氧化酶(ZEP)基因和紫黄质脱环氧化酶(VDE)540.一种包含PsbS基因的顺式调控元件中的倒位的基因修饰的植物，其中倒位增加42.根据权利要求41所述的改良植物，其中水稻植物是粳稻亚种(Oryzasativa43.根据权利要求40_42中任一项所述的改良植物，其中与没有44.根据权利要求40_43中任一项所述的改良植物，其中倒位涵盖45.根据权利要求40_44中任一项所述的改良植物，其中倒位包括1,00046.根据权利要求40_45中任一项所述的改良植物，其中对植物或47.根据权利要求40_46中任一项所述的改良植物，其中Ps50.根据权利要求40_49中任一项所述的改良植2固定和水利用效率中的一种或多种相关52.根据权利要求40_51中任一项所述的改良植物6[0001]本申请要求2022年4月11日提交的美国临时申请号63/329,831的权益，该申请通[0003]本公开涉及筛选靶基因的非编码区中的功能增益突变的方法。靶基因可以是NPQ本申请进一步涉及通过在靶基因的非编码区中引入功能增益突变来改良经济作物植物或[0004]优化光合效率仍然是工程化可持续和高产作物品种中最大的尚未完成的空白之一(LongSP,Marshall_ColonA,ZhuXG.Meetingtheglobalfooddemandofthefuturebyengineeringcropphotosynthesisandyieldpotential.Cell.2015；学猝灭(NPQ)(耗散过量吸收的光能所必需的光保护过程)的基因可提高模式作物烟草K,LeonelliL等人，Improvingphotosynthesisandcropproductivityby及水利用效率(GlowackaK,KromdijkJ,KuceraK等人，PhotosystemIISubunitSoverexpressionincreasestheefficiencyofwateruseinafield_grown表达参与NPQ的基因提高大豆的种子产量(SouzaA.P.D.,BurgessS.J.,DoranL.,Hansenimprovedbyacceleratingrecoveryfromphotoprotection.Science377,851_引起额外的调控复杂性，并且可能易受跨代基因沉默的影响(JamesVA,AvartC,WorlandB,SnapeJW,VainP.Therelationshipbetweenhomozygousandhemizygoustransgeneexpressionlevelsovergenerationsinpopulationsoftransgenic辑顺式调控元件也已证明了该方法通过在番茄(Rodríguez_LealD,LemmonZH,ManJ,BartlettME,LippmanZB.EngineeringQuantitativeTraitVariationforCrop7ImprovementbyGenomeEditing.Cell.2017；171(2):470_480.e8.doi:10.1016/yield_relatedtraitsbyCRISPR–Cas9启动子editingofmaizeCLEgenes.Nat率的瓶颈限制(WadaN,UetaR,OsakabeY,OsakabeK.Precisiongenomeeditingin实现这样的增益的强大渠道将迅速加速通过基因编辑在作物植物诸如水[0007]NPQ基因代表跨植物物种之间用于基因组编辑方法的有前景的途径，因为众所周[0008]为了满足这些需求，本公开提供了筛选靶基因(诸如NPQ基因(例如PsbS、VDE、[0009]本公开的方面包括筛选植物的靶基因中的功能增益(a)使用靶向靶基因的一种或多种RNA引导的核酸修饰酶在植物的植物细胞群中的靶基因不同的引导RNA；(b)将植物细胞群再生为两种或更多种对产生的突变而言为半合的植物；测序以鉴定功能增益突变。在该方面进一步的实施方式(其可与任一前述实施方式结合)的筛选包括筛选缺乏可选择标记的植物。在该光合量子产量和CO2固定中的一种或多种相关的表型，并且步骤(c)(2)的筛选包括通过叶8步骤(c)(2)的筛选包括通过叶绿素荧光筛选后代植物以鉴定对于突变而言假定为纯合的括使用具有靶基因的亚效等位基因或无效等位基因的植物。在该方面进一步的实施方式(其可与任一前述实施方式结合)中，与在相同条件下生长的缺乏功能增益突变的植物相施方式(其可与任一前述实施方式结合)中，靶向靶基[0011]在该方面的仍另一实施方式(其可与任一前述实施方式结合)中，植物为作物植(Nicotianatabacum)植物、水稻(Oryzasativa)植物、玉米(Zeamays)植物、高粱(Sorghumbicolor)(甜高粱或谷物高粱)植物、大豆(Glycinemax)植物、豇豆(Vignaunguiculata)植物、杨树(Populusspp.)植物、桉树(Eucalyptusspp.)植物、木薯9非光化学猝灭(NPQ)弛豫速率的增加；波动光条件下量子产量的改善，以及波动光条件下中载体包括包含SEQIDNO:9的两种或更多种gRNA支架，以及包含SEQIDNO:10的两种或[0013]本公开的一些方面涉及产生改良经济作物植物或作物种子的方法，所述方法包物包括水稻(Oryzasativa)植物、玉米(Zeamays)植物、或豇豆(Vignaunguiculata)植结合)中，对植物或其祖先筛选PsbS基因的顺式调控元件中的倒位以及增加的PsbS基因表[0017]图1A_1B显示粳稻亚种(Oryzasativasubspecies(ssp.)japonica)中OsPsbS1上游的用于CRISPR/Cas9突变形成的靶引导RNA(gRNA)位点。图1A显示在籼稻亚种(OryzaOsPsbS1的上游远端(深灰色)和近端(灰色)区中的Cas9图标)。在T1群(底部)中，预计25％的植物对于每个丢失携带Cas9的转基因(以灰色禁止符号表示)。图2B显示在PsbS敲除(x轴上的0)、杂合的_2s_1的蓝光10分钟后最大NPQ容量(在y轴上)的线性回归。图2C显示T0最大NPQ(在x轴上)与0代1代或两代中具有超过WT的+2SD的NPQ的个体分别显黑暗10分钟)的叶绿素荧光表型分析解析相对于WT(n＝4，菱形)的单个分离Cas9图标)。在T1群(底部)中，预计25％的植物对于每个丢失携带Cas9的转基因(以灰色禁止符号表示)。图2B显示在PsbS敲除(x轴上的0)、杂合的_[0019]图3A_3B显示横跨78个T0事件的120个假定的纯合等位基因的最大NPQ。图3A显示最高排序(从左到右)。显示了横跨所有表型分析实验的64个生物学重复的日本晴到的每种表型的比例，阴影与图3A中使用的相同；敲除＝21.67敲低＝15WT样=态叶绿素荧光值被平均以进行数据可视化(由5个黑色三角形表示)。初始Fv/Fm和高光照_2s_1处的稳态NPQ和2_4OX)的OsPsbS1的免疫印迹。图4F显示与事件19WT(最左侧)比较代表性事件19品系OX)。使用每个单独的数据点(显示平均值±1SEM)将数显示了事件2品系在1500μmolm_2s_1处残留Fv/Fm针对NPQ能力的线性回归：事件2日本晴WT析(α=0.05)使用Dunnett检验针对日本晴WT(图4B_4C)或各自的事件2或事件19过表达数据集(图4I)进行多重比较来确定(并用星号表示(**p≤0.01,***p≤0.001,****p<[0021]图5A_5E显示了具有不同PsbS丰度的事件2品系的叶绿素荧光和气体交换测量图5A显示了相对于单位为μE的不同红光强度(在x轴上)的NPQ(在y轴上)。图5B显示了相对[0022]图6A_6D显示了QA氧化还原态(1_qL)和gsw作为iWUE的预测因子的相关性，其中使用Dunnett检验针对日本晴WT对照进行多重比较来确定显著性。图6B显示了所有基因型示为±1SEM)。对于每个基因型，r2值显示在图下的表格中：2_1SKD＝0.9766；2_4OX=著性通过普通单向方差分析(α=0.05)使用Dunnett检验针对日本晴WT进行多重比较来确(ssp.japonica))启动子上在远端gRNA位点(灰色三角形)处显示了对于2_4_OX品系，含有OsPsbS1的1号染色体基因座(～1.1Mbp)的增加的分辨率点上游～3_4kb倒位(1号染色体37693800–37696800)的1号染色体基因座增加的分辨率。在图8B和8D中，灰色框表示OsPsbS1基因(LOC_Os01g64960)(在图8B的左上，和图8D的右(2_5_KO)中的OsPsbS1表达。图9B显示了来自一个时间点的qPCR结果，比较了过表达品系长度(DL)中生长。2_4_OX中的OsPsbS1转录水平仅在第一时间点统计学上显著更高(p<品系(2_4_OX)和弱敲低品系(2_6_WKD)中，当天的时间(t使用靶向靶基因的一种或多种RNA引导的核酸修饰酶在植物的植物细胞群的靶基因的非编进行测序以确定功能增益突变。在该方面进中的筛选包括筛选缺乏可选择标记的植物。在该方物以鉴定对于突变而言假定为纯合的无转基因植物些植物物种(例如水稻)中比PCR显著更便宜且更有效，因为PCR可能容易受到污染和假阳对于感兴趣的突变为纯合的品系是可能的。在该多种RNA引导的核酸修饰酶包括两种或更多种不同的引导RNA、三种或更多种不同的引导步的实施方式(其可与任一前述实施方式相结合)中，一可变剪接元件和下游调控元件。在该方面进一步的实施方式中，引导RNA靶向靶基因的5’等人，(2022)Variationinupstreamopenreadingframescontributestoallelic少90％同一性或至少95％同一性。在该方面物、桉树(Eucalyptusspp.)植物、木薯(Manihotesculenta)植物、大麦(Hordeumvulgare)植物、马铃薯(Solanumtuberosum)植物、甘蔗(Saccharumspp.)植物、苜蓿mays)植物或豇豆(Vignaunguiculata)植物。在该方面进种或多种不同的引导RNA，并且其中载体包括两种或更多种gRNA支架，所述gRNA支架包括SEQIDNO:9和两种或更多种具有SEQIDNO:10的tRN[0031]本公开的一些方面涉及产生改良经济作物植物或作物种子的方法，所述方法包倒位在植物或其祖先中随机产生。在该方面仍另一实施方式中，倒位使用引导RNA随机产又另一实施方式(其可与任一前述实施方式结合)中，增加的PsbS基因表达包括在早上的饰或改良植物部分的不可再生部分或细胞。如本文所用，基因修饰或改良植物或其部分的“不可再生”部分或细胞是其本身不能被诱导形成整株植物或不能被诱导形成能够进行有检测植物细胞培养物或植物中的光合的量(参见例如，Silva等人，AquaticBiology7:_Biology7:127_141,2009,以及其中引用的参考文献中描述的方法)。还可通过检测叶绿素_见，例如，Weising等人，Ann.Rev.Genet.22:421_477(1988)；美国专利5,679,558；Christou等人(TrendsBiotech,(1990)8,145)或WO0获得的种子优选包含基因改变作为染色体DNA中的稳定插入物或作为对内源性基因或启动源性基因的表达改变)通常将利用植物可表达的启动子。本文使用的“植物可表达启动子”CaMV35S启动子(Benfey&Chua,Science,(1990)250,959_966)、CaMV35S启动子的各种其毒启动子(国际申请WO97/48819)和拟南芥UBQ10启动子(Norris等人，Plant如分离株CM1841(Gardner等人，NucleicAcidsRes,(1981)9,2871_2887)、CabbBS 族的启动子(例如Christensen等人，PlantMolBiol,(1992)18,675_689的玉蜀黍泛素启TheorApplGenet,(1990)81,581_588)、肌动蛋白启动子(诸如An等人描述的启动子(ThePlantJ,(1996)10,107))、Zhang等人描述的水稻肌动蛋白启动子(ThePlantCell, (1987)15:8451_8466)、木薯脉花叶病毒的启动子(WO97/48819；Verdaguer等人，MolBiol,(1998)37,1055_1067)、来自地三叶草矮化病毒的pPLEX系列启动子(WO96/06932，尤其是S4或S7启动子)、醇脱氢酶启动子(例如pAdh1S(GenBank登录号X04049、[0055]组织特异性启动子的另外的非限制性实例包括玉蜀黍别硫氨酸启动子(DEFRAMOND等人，FEBS290,103_106,1991；申请EP452269)、几丁质酶启动子(SAMAC等人，PlantPhysiol93,907_914,1990)、玉蜀黍ZRP2启动子(美国专利号5,633,363)、番茄子(PCT申请WO02/46439)和拟南芥pCO2004)。组织特异性启动子的进一步非限制性实例包括RbcS2B启动子、RbcS1B启动子、RbcS3B启动子、LHB1B1启动子、LHB1B2启动子、cab1启动子，以及Engler等人，ACS[0057]本公开的引入基因可插入宿主细胞DNA中，(Depicker等人，J.MolecApplGen,(1982)1,561_573)、章鱼碱合酶基因(Gielen等人，(2003)30:453_460)和TDNA基因7(Velten和Schell,NucleicAcidsRes,(1985)13,6981_合到核基因组中可通过本领域中任何已知的方法实现[0061]在一些实施方式中，非整合的表达系统可用于诱导一种或多种引入基因的表达。教导有用的主题调控序列足够的同源性，对于鉴例如Sambrook等人(1989)(见下文)或Ausubel等人(1995)，MolecularBiology中的[0064]此外，可使用聚合酶链式反应(PCR)对基因改变的株系进行筛选和分子分析以及引物退火至其互补序列以及用DNA聚合酶延伸退火的引物的这些重复循环导致由PCR引物所用，两个核酸的百分比序列同一性使用本领域已知的算法来确定，诸如由Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264_2268公开的算法(修改为Karlin和一性的核苷酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，如Altschul等人，(1997)员通过使用具有默认设置的合适BLAST程序将感兴趣的序列与参考序列比对，可容易地确蛋白质的核酸可通过本领域已知的适合特定类型细独存在或与其它组成组合存在，但与其天然环境不同或不在其天然环境中的DNA分子或其列不在编码该蛋白质的序列在其天然位置中天然发现的生物体的DNA内，或者该核苷酸序[0070]本实施例描述了用于筛选在OsPsbS1上游由CRISPR/Cas9非编码序列诱变产生的新颖等位基因的高通量流程。本实施例中呈现的发现揭示了产生活性大的表型范围的能[0071]将水稻品种日本晴(粳稻亚种(Oryzasativassp.japonica))种子在Whatman滤并于温度(高温38℃/低温16℃)和相对湿度(45_60％)波动的朝南温室中在季节性日照(10_14小时)下生长。在发芽后2周移植后以及发芽后10周的籽粒灌浆(grainfilling)开温室具有更均匀的光照暴露、田间相关的生长条件(高温40℃/低温27℃,30_50％相对湿[0073]利用CRISPR_P(crispr[dot]hzau[dot]edu[dot]cn)在水稻功能性PsbS直系同源物OsPsbS1(LOC_Os01g64960)的上游鉴定了8个引导RNA(gRNA)靶位点，并在籼稻亚种(Oryzasativassp.indica)品种IR64的基因组草图中鉴定了OsPsbS1起始密码子上游的的(XieK,MinkenbergB,YangY.BoostingCRISPR/Cas9multiplexeditingcapabilitywiththeendogenoustRNA_processingsystem.ProcNatlAcad通过GoldenGateAssembly将插入物克隆到pRGEB32水稻农杆菌介导的转化载体(Addgene的SpCas9的表达，并且潮霉素抗性基因(HygR)用于农杆菌介导的胚性水稻愈伤组织的转[0074]每种候选gRNA间隔序列被合成为ssDNA寡聚体，该ssDNA寡聚体具有分别用于T7℃下复合20分钟，然后将复合的核糖核蛋白与100ng的PCR扩增的OsPsbS1(籼稻亚种表2：用于体外Cas9_gRNA编辑籼稻亚种(O.sativa(ssp.indica))OsPsbs1非编码[0075]将水稻(粳稻亚种品种日本晴(O愈伤组织诱导培养基(CIM)(N6盐和维生素(Chu,C.C.等人，Establishmentofanefficientmediumforanthercultureofrice,throughcomparativeexperiments[0076]将胚性愈伤组织干燥30分钟，然后与携带克隆的双元载体pRGEB32_OsPsbS1_8xgRNA的根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105悬浮液(OD600nm＝0.1)一起孵pH5.8)，并且在28℃下于黑暗下孵育7天。然后将愈伤组织转移至选择培养基(CIM加上素(Murashige,T.&Skoog,F.ARevisedMediumforRapidGrowthandBioAssayswith_幅度调制式荧光仪在室温下确定体内叶绿素荧光测量值。暗适应后(F0、Fm)和光适应期间m[0079]为了解析来自单个亲本的表型分离的OsPsbS1NCS基因编辑的等位基因，使用周期性饱和脉冲将V3叶期的单个叶片穿孔暴露于4分钟时间段的高强度光化性光(1500μmolm_2s_1脉冲在10分钟时间段的高强度光化性光(1500μmolm_2s_1)和10分钟黑暗弛豫(0μmolm_2s[0081]随后使用测定NPQ能力的漂浮的叶片穿孔来确定潮霉素敏感性和转基因的分离。发芽室的条件下孵育三天，然后使用成像_PAMMaxi从具有不同NPQ的代表性品系提取总RNA(FastPrep_24TM)的无RNA酶、无DNA酶试管建议使用Omniscript逆转录酶(Qiagen)以及随机六聚体与寡聚dT的1:1混合物将mRNA转化公布的方法在具有技术重复的三个生物学重复中，将qRT_PCR表达标准化为多个参考基因(Vandesompele,J.等人，Accuratenormalizationofreal_timequantitativeRT_PCRdatabygeometricaveragingofmultipleinternalcontrolgenes.GenomeBiol3,relativequantificationframeworkandsoftwareformanagementandautomatedanalysisofreal_ti的1:10稀释的cDNA将样品在7500快速实时PCR系统(AppliedBiosystems，比利时根特)上Fu,X等人中进行了描述。OsbZIP72和OsMYBS2以相反作用的配合调节水稻中OsPsbS1的转Khurana,J.P.Validationofhousekeepinggenesasinternalcontrolforgeneexpressioninricebyquantitativereal_timePCR.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications345,646–651(2006)中进行了描述。在早上(图9A)、晚上(图9B)和生长室生长的植物的时间过程[0084]将沉淀的蛋白质重悬于供应的蛋白质溶解缓冲液(PSB_TCEP)中，并使用TCA比色分析进行定量(Karlsson,J.O.,Ostwald,K.,Kabjorn,C.&Andersson,M.AMethodfor的β亚基(Atpβ)的合成肽培育的兔多克隆抗体获自Agrisera(目录号AS05085)，并且以1:10,000稀释来使用。与来自GEHealthcare的HRP偶联的抗兔二抗(1:10,000稀释)孵育后，使用SuperSignalWestFemto最大灵敏度底物(ThermoScientific)通过化学发光检测条8周龄营养水稻植物的最嫩的完全展开的叶片进行表型分析。整株植物在黑暗中适应1小[0086]对12周龄开花水稻植物的最嫩、完全展开的旗叶进行光合气体交换动力学测使用配备有2_cm2叶室和集成调制荧光℃室温、其中每个光阶(lightstep)适应10_20分钟。当气孔导度gsw在经40秒的时间段内保持小于0.005+/_0.00025SD的斜率，并且当净同化率(netassimilationrate)An在经段内显示小于0.5+/_0.25SD的变化时，即达到稳态。记录净同化率、气孔导度和细胞内[CO2vos[0088]经由珠磨法(beadbeating；LysingMatrixD,FastPrep_24TM)研磨50mg的叶组[0091]使用PacBioSequelII(QB3Genomics,UCBerkeley,加州伯克利,RRID:SCR_022170)在单个8MSMRTcell上通过HiFi环状共识测序(CCS)对HMWgDNA进行汇集和测序。使用FastQC(www[dot]bioinformatics[dot]babraham[dot]ac[dot]uk/projects/fastqc/)对过表达品系N2_4_OX和N19_1_OX的未整理读段进行首次质量检查。使用pbmm2(PacificBiosciences专为HiFi读段而开发的minimap2包装器)将读段映射用pbIPA(PacificBiosciences分阶段组装器(github[dot]com/PacificBiosciences/pbbioconda))进行组装。Sniffles(github[dot]com/fritzsedlazeck/Sniffles)和pbsvGenies(D_GENIES:dotplotlargegenomesinaninteractive,efficway[PeerJ].Peerj[dot]com/articles/4958/)用于将从头组装与参考基因组比对并生成点图。IntegrativeGenomicsViewer(Robinson,J.T.等人，Integrativegenomicsviewer.NatBiotechnol29,24–26(2011))用于可视化映射读段、对齐组装和sniffles结[0092]为了在OsPsbS1导的转化将八个特异性且进化保守的引导RNA(gRNA)靶位点(表1)引入水稻(粳稻亚种(Oryzasativassp.japonica))品种日本晴愈伤组织中。该设计避免了靶向对于水稻段(Kasajima,I.等人，Moleculardistinctioningeneticregulationofnonphotochemicalquenchinginrice.ProceedingsoftheNationalAcademyofofNaturalVariationinRiceNonphotochemicalQuenchingCapacityRevealedby顺式调控元件都是纯合的，并且预计1/4的子代已丢失携带Cas9和植物抗生素抗性盒的转鉴定对于任一OsPsbS1等位基因[A/A或a/a]是杂合的[A/a]或纯合的子代的两个等位基因[0094]PsbS是其中功能丧失突变表现出半显性的基因。这些突变显示出拷贝数和NPQ能以确定NPQ能力和Cas9转基因分离的差异。通过表型鉴定出评估NPQ能力的叶片穿孔用植物选择性抗生素潮霉素处理，并监测光系统II的量子效率[0096]分离的120个稳定的等位基因的近三分之二的N第二和第三最大组分别是敲除表型(21.67％)和敲低表型(15％)。分离两个独立显示出显著降低的NPQ能力(分别为p<0.0001和p＝0.0041)。相反，事件19_1过表达[0098]OsPsbS1蛋白的免疫印迹分析突出显示了绝对蛋白丰度(图4D)和相对于日本晴WT位基因(2_6_WKD)分别积累了WTOsPsbS1蛋白水平的1/8能拟合所有基因型在1500μmolm_2s_1处的OsPsbS1蛋白丰度和NPQ能力之间的对数关系(r2=0.7872)，这与先前在拟南芥(A.thaliana119)中观察到的PsbS剂量依赖性活性一致(图19_1_OX)在800μmolm_2s_1和1500μmolm_2s_1处相对于该光强度下的其他基因型均显示出[0100]先前的研究已表明，PsbS的转基因过表达并未损害水稻的稳态CO2同化作用(Hubbart,S.等人，Enhancedthylakoidphotoprotectioncanincreaseyieldandcanopyradiationuseefficiencyinrice.CommunBiol1,22(2018)；Hubbart,S.,Ajigboye,O.O.,Horton,PcontroloverCO2assimilationrateinfluctuatinglightinrice:PhotoprotectionandCO2assimilationinrice.ThePlantJournal(2012)doi:率(iWUE)(Gtowacka,K.等人，PhotosystemIISubunitSoverexpressionincreasestheefficiencyofwaterusei致，敲低品系2_1_SKD和2_6_WKD在大于500μmolm_2s_1的光强度下相对于日本晴WT对照显示出显著更低的NPQ(p<0.0001)。而2_4_OX仅在1500和2000μmolm_2s_1处显示出显著更高表型与日本晴WT没有显著差异(图5A_5E)。2_6_WKD的轻度敲低在超过500μmolm_2s_1的光[0102]与增加的ΦPSII一致，PsbS的弱敲低也在超过500μmolm_2s_1的光强度下增加了态由1_qL近似表示(Gtowacka,K.等人，PhotosystemIISubunitSoverexpressionincreasestheefficiencyofwateruseinafield_growncrop.NatCommun9,868进行了绘图。虽然观察到显著的非线性(p<0.0001)和相对强的拟合良好性(所有点r2=弱(Gtowacka,K.等人，PhotosystemIISubunitSoverexpressionincreasestheefficiencyofwateruseinafie7_WT样对照外，所有QA氧化还原态和气孔导度的线性回归都与日本晴WT显著不同，因为[0106]NPQ能力、蛋白丰度和iWUE的差异证实了观察到的由非编码序列诱变产生的表型5’UTR内和附近的近端gRNA变体来解释。对具有不同NPQ的事件2品系的顺式调控分析(图识测序(PacificBiosciences)对纯合的2_4_OXT2品系和分离的19_1_OXT1品系进行了测装读段并将其映射到日本晴水稻(O.sativa)v7.0参考基因组上(Hellemans,J.,Mortier,G.,DePaepe,A.,Speleman,F.&Vandesompele,J.qBaserelativequantificationframeworkandsoftwareformanagementandautomatedanalysisofreal_timeSNP)在2_4_OX和19_1_OX之间具有高度一致的模式，这可能代表了参考基因组和使用的实[0110]OsPsbS1的1号染色体基因座的分辨率提高强调了在全基因组规模上无法观察的结构变异的大的差异。在图8A中，显示了2_4_OX品系中含有OsPsbS1的1号染色体基因座查看器(IGV)进行可视化，这在序列水平上得到了进一步证实。图8B显示了对于2_4_OX品系，具有OsPsbS1上游～254kb倒位(Chr1:37693233–37948089)的1号染色体基因座的分辨率增加。而19_1_OX品系在含有OsPsbS1的1号染色体基因座(～1.5Mbp)的增加的分辨率点平看出的变化的影响。这些结果出乎意料地表明，过表达表型(即NPQ)是组成型的，但Cas9工具包有潜力满足该需求。本实施例中显示的结果证明了利用CRISPR/Cas9诱变非编P.,Gilmore,A.M.&Niyogi,K.K.PsbS_dependentenhancementoffeedbackde_excitationprotectsphotosystemIIfromphotoinhibition.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences99,15222–15227(2002)；Hubbart,S.等人，Enhancedthylakoidphotoprotectioncanincreaseyieldandcanopyradiationuseefficiencyinrice.CommunBSubunitSoverexpressionincreasestheefficiencyofwateruseinafield_growncrop.NatCommunImpactsofWidespreadStructuralVariationonGeneExpressionandCrophigh_qualitygenomesrevealpan_genomearchitectureandecotypedifferentiationofBrassicanapus.ExtensiveintraspecificgeneorderandgenestructuralvariationsbetweenMo17andothermaizegenomes.NatGenet50,1289–1295(2018))、葡萄树(Zhou,Y.等人，Thepopulationgeneticsofstructuralvariantsingrapevinedomestication.Nat.Plants5,965–979(2019))和水稻(Qin,P.等人，Pan_genomeanalysisof33geneticallydiversericeaccessionsrevealshiddengenomicgenomicstructuralvariation:insightsfromandforhumandisease.NatRevGenet14,125–138(2013)；Beyter,D.等人，Long_readsequencingof3,622Icelandersprovidesinsightintotheroleofstructuralvariantsinhumandiseasesandothertraits.NatGenet53,779–786(2021)；Hehir_Kwa,J.Y.等人，Ahigh_quhumanreferencepanelrevealsthecomplexityanddistributionofgenomic和重组驱动—两者都被记录为作物驯化的关键驱动oftransposableelementsontomatodiversity.NatCommun11,4058(2020)；Gaut,B.S.,Seymour,D.K.,Liu,Q.&Zhou,Y.Demographyanditseffectsongenomicvariationincropdomestication.Nature[0117]事实上，染色体倒位还牵涉在桃子驯化过程中的基因过表达(Zhou,H.等人，A1.7_MbchromosomalinversiondownstreamofaPpOFP1geneisresponsibleforflatfruitshapeinpeach.PlantBiotechnologyJournal19,192–205(2rearrangementshijackenhancersbutmostlysuper_enhancerstodysregulateMYCexpressioninmultiplemyeloma.LeuCRISPR/Cas9可用于经由启动子交换来驱动天然过表达(Lu,Y.等人，Adonor_DNA_freeCRISPR/Cas_basedapproachtogeneknock_upinrice.Nat.Plants7,1445–1452而，这些倒位的代价是相反启动子的表达，从而敲除了目标卡尔文_本森循环蛋白12[0118]在数据集中，含有倒位的过表达等位基因占13个无法进行PCR扩增和测序的独特[0119]本实施例描述了经由CRISPR/Cas9诱变靶向水稻(O.sativa)VDE(OsVDE,LOC_Os04g31040)以及ZEP(OsZEP,LOC_Os04g37619)，以便经由改变的内源性基因表达重现VPZ表型(KromdijkJ,GlowackaK,LeonelliL等人，Improvingphotosynthesisandcropproductivitybyacceleratingrecoveryfromphotoprotection.Science.2016；354[0120]在OsVDE和OsZEP的启动子和5’UTR上游内，鉴定出五至八个引导RNA(gRNA)靶位下，上游基因将假定的启动子和5’UTR限制为～750bp。使用CRISPR_P(crispr[dot]hzau险和2)跨感兴趣的靶位点均匀分布。对于显著大于300bp的靶位点，每～200_300bp确定如先前所述(XieK,MinkenbergB,YangY.BoostingCRISPR/Cas9multiplexeditingcapabilitywiththeendogenoustRNA_processingsystem.ProcNatlAcad入物经由GoldenGate组装克隆到pRGEB32水稻农杆菌介导的转化载体(AddgenePlasmid#所述进行NPQ表型和基因表达差异的筛选，以鉴定具有可遗传编辑等位基因的稳定的纯合[0124]在日本晴(粳稻亚种(O.sativassp.Japonica))中的编辑方法跨OsPsbS1起始密1中描述的结果发现所有5个远端gRNA位点都是非必需的_跨越所有5个位点的缺失导致子或更大程度的过表达方面更有前景，对拟南芥(A.thaliana)PsbS(AtPsbS,At1g44575)和VDE(AtVDE,At1g08550)基因的NCS(其下游表型可通过叶绿素荧光成像快速解析)进行了编[0127]使用CRISPR_P(crispr[dot]hzau[dot]edu[dot]cn)在AtPsbS和AtVDE的NCS内鉴对于显著大于300bp的靶位点，每～200_300bp确定gRNA。对于<300bp的靶位点，每～50_和AtVDE的NCS诱变的片段长度和gRNA靶标的概述。表7和表8分别提供了用于AtPsbS和如先前所述(XieK,MinkenbergB,YangY.BoostingCRISPR/Cas9multiplexeditingcapabilitywiththeendogenoustRNA_processingsystem.ProcNatlAcad入物经由GoldenGate组装克隆到pKI1.1R拟南芥农杆菌介导的转化载体(Addgene[0129]WT拟南芥Col_0用表6中总结的7个构建体的每一个进行转化。收集携带Cas9和用实施例4：水稻(OryzaSativa)、玉米(Zeamays)和豇豆(VignaUnguiculata)[0131]本实施例描述了水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)和豇豆