CN119487214A 膀胱癌生物标志物和使用方法 （诺根生物科学公司）

2025.01.02PCT/US2023/0675622023.05.26WO2023/230617EN2023.11.302mRNA的水平；(d)使所述mRNA水平相对于所述样品中的至少一种参考mRNA转录物的水平归一化，以(a)使用至少一个处理器存取电子存储的训练数据向量集，每个训练数据向量表示个体癌症患者并且包含相应癌症患者的RNA表达数据，每个训练数据向量进一步包含关于选(e)基于所述评估步骤输出关于在膀胱癌不复发的情况下长期存活的可能性的所述测4.根据权利要求3所述的方法，其中所述分类系统是AdaBoost、人6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述mRNA水平是通过微阵列分析、7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述mRNA是通过定量PCR(qPCR)来确38.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中样品中或不同生物样品中的泌尿生殖器相关癌症类型的至少一种另外的生物标志物并对样品中或不同生物样品中的不同癌症类型的至少一种另外的生物标志物并对所述至少一20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其4(b)使从受试者获得的生物样品与结合剂套组接触，其中所述套组包含与选自由以下(a)使用至少一个处理器存取电子存储的训练数据向量集，每个训练数据向量表示个(e)基于所述评估步骤输出关于上尿路上皮癌(UTUC)的可能性的所述测试数据的分29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，其中所述样品是从具有UTUC的至少一38.一种阵列，其包含固定到底物的选自由以下组成的组的生物标志物：ANG、A1AT、56[0002]本申请要求于2022年5月27日提交的美国临时申请第63/346,468号以及于2023年率为大约94相比之下，当注意到疾病为MIBC(2期)时，5年存活率为至多50并且当疾者获得生物样品；(b)从所述生物样品中分离mRNA；(c)确定所述生物样品中ANG、A1AT、7[0011]在一实施例中，一种对测试数据进行分类的方法，所述测试数据包含RNA表达数练数据向量表示个体癌症患者并且包含相应癌症患者的RNA表达数据，每个训练数据向量据；以及(e)基于所述评估步骤输出关于在膀胱癌不复发的情况下长期存活的可能性的所所述确定步骤可以使8的泌尿生殖器相关癌症类型的至少一种另外的生物标志物并对所述至少一种另外的生物的不同癌症类型的至少一种另外的生物标志物并对所述至少一种另外的生物标志物进行所述处理器执行包含以下的步骤：从远离所述服务器定位的计算机终端接收mRNA表达数向量进一步包含关于选自由以下组成的组的生物标志物的表达水平的分类：ANG、A1AT、数据向量集来训练分类系统的电子表示；(c)在所述至少一个处理器处接收包含蛋白质表所述测试数据；以及(e)基于所述评估步骤输出关于上尿路上皮癌(UTUC)的可能性的所述9[0032]在一实施例中，阵列可以包含固定到底物的选自由[0039]图3A_B描绘了(A)热图，其展示了与OncuriaTM相关的1到高的基因表达的趋势。(B)来自膀胱癌签名的与管腔亚型与基底亚型相关的单独生物标[0049]图13AC描绘了本文以下中所描述的组合的生物标志物签名的高表达相对于低表院刊(ProcNatlAcadSciUSA)》(2014)111:3110一3115；Choi等人.《癌细胞(Cancer鉴定并验证了膀胱癌诊断签名，所述膀胱癌诊断签名包含10种生物标志物(ANG、APOE、膀胱癌的分子复杂性限制了依赖于用于检测和预测膀胱癌行为的单一特征或生物标志物[0058]定量监测膀胱癌相关诊断签名的多重免疫测定可以包含10种蛋白质生物标志物[0059]一系列实体瘤的分子亚型分型已经成为将患者分类为遗传同源组以指导临床管在膀胱癌的分子亚型分型和临床结果的预测中的潜在效用。[0060]基于RNA的测试具有RNA降解的缺点，并且难以从患者获得新鲜组织样品以供分定组织中提取更高数量和质量的RNA。所述微阵列可以包含选自由以下组成的组的生物标[0061]通过RNA基因表达分析对膀胱癌的分类集中于改善和完善通常在膀胱癌中看到的[0063]由发明人选择的生物标志物的分类在存档石蜡包埋的活检材料上训练以测试该文所述的方法指定可以用于测试中的寡核苷比较来确定所述受试者的预后，其中步骤(a)中高水平的一种或多种癌症生物标志物指示获得的膀胱癌组织样品中的一种或多种预后RNA转录物或其表达产物的表达水平，相对于物的参考集合，其中所述预后RNA转录物是选自由以下组成的组的一个或多个基因的转录[0069]在本文所述的方法中，所述方法可以包含确定所有预后RNA转录物或其表达产物(RNAPurificationandAnalysis:SamplePreparation,Extraction,Chromatography)”[0070]一种预测被诊断为患有侵入性膀胱癌的患者的长期存活的可能性的方法可以包[0081](a)使包含从患者获得的膀胱癌细胞的样品经受对至少一种选自由以下组成的组冲液/试剂和方案；以及(3)适合于执行本文所述的方法中的任一种的qPCR缓冲液/试剂和方案。试剂盒可以包含阵列，任选地微阵列，所述微阵列包含由以下组成的cDNA转录物：非侵入性获得的尿样品的准确诊断测定的开发将有益于患者和医疗的作用有限。应用稳健的基于尿液的多重测定来辅助诊断UTUC解决这种缺陷并帮助准确、关。高级别UTUC、低级别UTUC、非浸润性UTUC和浸润性UTUC的细胞学的灵敏度值分别为[0094]用于检测上尿路上皮癌(UTUC)生物标志物的方法可以包含：(a)从受试者获得生式的免疫测定，例如放射免疫测定、化学发光免疫测定和荧光免疫测定、酶联免疫测定[0100]本发明尤其涉及基于关于RNA转录物的表达水平的定量数据表征生物标志物，优学习系统以产生关于癌症的诊断(任选地膀胱癌)的[0104]训练数据库是反映与关于生物标志物水平的诊断和/或预后表征的分类相关的多[0106]数据上可以使用许多可能的分类器。机器和深度学习分类器包括但不限于括但不限于包装法(前向、后向和逐步选择)、过滤法(ANOVA、皮尔逊相关(Pearson限于随机森林。另见Kamiński等人.(2017)“决策树灵敏度分析的框架(Aframeworkforsensitivityanalysisofdecisiontrees)”.《中欧运筹学杂志(CentralEuropean 策规则的生成和解释(GenerationandInterpretationofTemporalDecisionRules)”，《国际计算机信息系统和工业管理应用杂志(InternationalJournalof[0114]分类树通常是有噪声的。随机森林试图通过取许多树的平均数来减少这种噪结果是与分类树相比，其误差已减小方差的分类器。构和随机NB(RandomMulticlassClassification:GeneralizingRandomForeststoApplications)》.《计算机科学讲义(LectureNotesinComputerScience)》.4653；Denisko和Hoffman(2018)“随机森林中的分类和交互(Classificationandinteraction[0118]AdaBoost提供了基于每个受试者的一个k维向量(称为k元组)将n个受试者中的每具有较差的预测性能(尽管比随机预测性能更好)，并且将其组合以产生优异的分类器。概念与技术》,第2版.阿姆斯特丹的爱思唯尔出版社,所述文献的内容通过引用并入。络学习传统算法中是手动设计的滤波器。这种与先验知识和人类在特征设计中的努力的独立性是一个主要优势。LeCun和Bengio(1995)“图像、语音和时间序列的卷积网络 (Convolutionalnetworksforimages,speech,andtime_series)”,Arbib(编辑版),省理工学院出版社(MITPress)》.全卷积指示神经网络由卷积层构成，而没有通常在网络生物标志物测量的一个k维向量(称为k元组)将n个受试者中的每个受试者分类为两个或更学习理论概述(Anoverviewofstatisticallearningtheory)”《IEEE神经网络汇刊[0123]可以使用称为高斯径向基函计语言中的实施的讨论可见于Karatzoglou等人.“R中的支持向量机(SupportVector的所有SVM统计计算。在kernlab包中使用ksvm()函数拟合SVM。Cristianini,N和Shawe_Taylor,J.(2000).支持向量机和其它基于内核的学习方法的简介(AnIntroductiontoSupportVectorMachinesandOtherKernel_basedLearning[0128]贝叶斯分类器的组是基于贝叶斯定理的一组分类器。参见例如，Joyce(2003),Zalta,EdwardN编辑,“贝叶斯定理(Bayes'Theorem)”,《斯坦福哲学百科全书(The实验室(MetaphysicsResearchLab,[0129]所有这种类型的分类器都试图在给定观察数据的情况下找到观察属于某个类的[0132]用于实施如本文所论述的朴素贝叶斯分类器的工具可用于统计软件计算语言和以通过任意地定义任何两个组之间的距离来克服。此类算法也对尺度和度量的变化敏感。[0144]用于实施如本文所论述的k最近邻分类器的工具可用于统计软件计算语言和环境分类系统之一评估从个体获得的测试数据(与训练数据相比)。优选的分类系统使用分类[0151]一种对测试数据进行分类的方法，所述测试数据包含生物标志物子集的定量RNA组表示单个生物标志物并且包含每个重复试验的相应生物标志物的RNA表达水平数据，所用所述电子存储的一组训练数据向量来训练如本文所述的分类器或分类器集合的电子表读形式在电子显示器中显示关于人测试受试者的允许本发明的处理器和/或存储器与任何其它实体通信；例如以获得另外的指令或访问并许用户在计算机处理一组指令和/或向计算机提供信息时接收关于计算机的操作的信息的品中(优选地膀胱癌患者或有患膀胱癌风险的人的尿液中)的本发明的生物标志物的存在人的生物样品中(优选地膀胱癌患者或有患膀胱癌风险的人的尿液中)的本发明的生物标[0169]用于检测生物样品中本发明的生物标志物的存在的优选的寡核苷酸是与编码生[0170]寡核苷酸可以使用本领域已知的任何已知化学寡核苷酸合成方法化学合成。Ausubel等人.[编辑]《精编分子生物学实验指南(ShortProtocolsinMolecular 100个核苷酸范围内的寡核苷酸是优选的。用于检测尿液样品中的生物标志物的最优选寡[0172]然后使用标准技术分离和纯化选择用于与生物标志物核无论是化学合成还是通过重组DNA技术合成，并且然后优选地使用标准标记方案进行标记[0173]寡核苷酸对可以用于聚合酶链式反应(PCR)中以检测生物样品中生物标志物的表[0175]编码本文所述的生物标志物的核酸分子可以在生物标志物阳性癌细胞内的生物语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含基因的两种不同加工产物的比较，其在正常受试者与患有疾病特别是癌症的受试者之间，表达模式在例如正常细胞和患病细胞之间或在经历不同疾病事件或疾病阶段的细胞中的特区的史密森学会国家自然历史博物馆(NationalMuseumofNaturalHistory,SmithsonianInstitutioninWashingtonD.C.)保存的世界哺乳动物物种(Mammal[0198]如本文所使用的，“负预测值(NPV)”是真负数(TN)除以真负数(TN)加上假负数(如肌苷)或经修饰的碱基(如氚化碱基)的DNA或RNA包括在如本文所定义的术语“多核苷患者在手术和/或终止化疗或其它治疗方式后的是否可能长期存活的有价值通过任何方法预处理和/或可以在不干扰测定的任何便利培养基中制备。可以在使用前处[0219]图1中描绘了发明人用来发现和验证诊断性膀胱癌签名的方法。发明人开发了这[0220]为了从微阵列数据导出诊断性最佳多基因诊断签名，应用了LoSun等人.《IEEE模式分析与机器智能汇刊(IEEETransPatternAnalMachIntell)》.免计算模型与训练数据的可能的过拟合，使用留一法交叉验证(LOOCV)方法来估计分类器变决策阈值获得的接受者操作特性(ROC)曲线(vanVliet等人.《BMC基因组学(BMCGenomics)》(2008)9:375)用于提供在不同灵敏度和特异性水平下如何执行预测模型的直在蛋白质水平下验证这14种生物标志物。在来自127名患者(64名患有膀胱癌)的独立群组名复发性癌症和72名非肿瘤复发)的群组中在复发性膀胱癌的检测方面表现同样好，在这种情况下，分别在79％和88％、42％和94％以及33％和90％的灵敏度和特异性方面优于疫测定。在两个大型独立群组中测试多重免疫测定的原型。在200名患者(100名患有膀胱癌)的美国群组中，免疫测定在81％的特异性下实现了80％的诊断灵敏度(Shimizu等人.本群组中，多重免疫测定的优化迭代在81％的特异性下实现了85％的诊断灵敏度 技术平台上测试并比较了多重免疫测定的性能(Furuya等人.《诊断学(Diagnostics)》 到10种分析物中的9种分析物在人膀胱肿瘤中过表达(n＝25；Gouin等人.《自然通讯([0226]进行了由362名患者(46名患有膀胱癌)的群组组成的小型临床验证研究。膀胱癌 19.6％的病例被报告为低级别癌症，并且80.4％的病例被报告为高级别(Hirasawa等人.[0227]分析来自癌症基因组图谱(TCGA)的膀胱癌患者的转录和存活数据中的10种分析[0230]为了进一步验证膀胱癌中的10种分析物，如本文所述对来自黑色人种群组表达的肿瘤与改善的总存活概率相关(HR＝2.05(1.19_3.52)，p＝0.0118)(图7)。在比，注意到具有10种分析物的总低表达的肿瘤与改善的总存活概率相关(HR＝4.38(2_[0232]发明人使用独立的自然排出的尿液样品的验证样品集验证了包含10种分析物的细胞RNA样品中测量靶转录物。构建TaqMan"低密度阵列(TLDA)以包括44个候选生物标志物靶标加上通过筛选整个样品群组中的15个常用内源性对照的水平而选择的4个选择的内源性对照(上文和下文描述)。生物标志物靶标主要选生物分析仪2000(AgilentBioanalyzer2000)定量和定性地评估经纯化的RNA样品。根据可用性，使用高容量cDNA逆转录酶试剂盒(加利福尼亚州福斯特市的应用生物系统公司引物由20ng至500ng的总RNA合成互补D[0233]通过在以下15个内源性参考靶标的多重PCR预扩增反应中使用每个样品cDNA的等每个cDNA样品和25μlTaqMan"PreAmp主混合物(2X)以50μl的最软件(西班牙格拉纳达的Integromics公司(Integromics,Granada,Spain))鉴定跨先前样[0234]通过由应用生物系统公司(AB)使用探针将跨越外显子接合的预先设计的测定构测定试剂与7.5μl每个cDNA样品和15μlTaqManPreAmp主混合物(2X)以30μl的最终体积组增反应中使用十微升未经稀释的预扩增产物，将其与50⃞l2XTaqMan"通用PCR主混合物[0235]用RQ管理器(AB)和StatMiner(Integromics公司)软件包处理实时PCR扩增结果。[0236]通过使用L1正则化逻辑回归来建立预测模型(即，以预测给定样品作为癌症或对照的实际状态)实现了最佳诊断分子签名的推导。L1正则化学习算法的快速实施方法的策交叉验证(LOOCV)方法来估计预测性能。Lodewyk等人.《生物信息学(Bioinformatics)》公司(MedCalcSoftware,Mariakerke,Belgium))进司)作为每个板上的校准物进行归一化来计算差异表达值。绘制KM曲线以可视化每个预测有有效的存活数据(19名正常和411名癌症)。数据集仅包括一名非肌层浸润性膀胱癌疗法(NAC)治疗的MIBC，GSE48075具有用或不用NAC治疗的NMIBC与MIBC的混合，并且[0247]从基因组数据共享中心(GenomicDataCommons，GDC)数据门户下载来自TCGA的膀胱尿路上皮癌IlluminaHi_Seq计数，并且经由TCGA临床数据资源访问包括存活信息的[0249]普兰_迈耶曲线用于确定单独生物标志物(低表达相对于高表达)与预后之间的关[0251]通过单变量Cox回归来评估与每个多重测试相关的生物标志物，并且然后使用多[0255]使用来自TCGA和GEO的一系列基因表达数据集，发明人评估了包含诊断签名的10[0256]发明人还测试了本文所述的生物标志物子集是否相对于膀胱癌的以下六种分子存活率的显著改善相关(图4)。表5报告了Cox单变量和多变量分析，其中VEGFA、MMP9、SERPINA1和SERPINE1与存GSE32894，疾病特异性存活概率，HR＝4.38(2_9.6)，p＝0.0012)(分别图13A_C)。在[0261]表6与膀胱癌相关签名相关的差异表达基因的基因本体通路分析中报告的顶级生[0265]尿路上皮癌在病理上被分类为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)或肌层浸润性膀胱癌多的NMIBC患者(50％至80％)具有肿瘤复发(vanderHeijden和Witjes《欧洲泌尿学增刊(EuropeanUrologySupplements)》(2009)8:556_562)，并且高达45％在5年后进展到后评估模型可能能够更好地指导个体化治疗并改善结果平可以将患者分层为管腔(VEGFA(p＝4.36e_8)和SDC1(p＝1.62e_13)或基底(MMP9(p=标志物活性(表6)。本文所述的生物标志物子[0271]为了评估能够查询排出的尿液样品中的10种与尿路上皮癌相关的蛋白质生物标关。高级别UTUC、低级别UTUC、非浸润性UTUC和浸润性UTUC的细胞学的灵敏度值分别为所述的多重免疫测定显示出在疑似携带UTUC的患者的非侵入性评估中的[0277]根据机构审查委员会的批准和知情同意书，在西达赛奈医疗中心(Cedars_SinaiMedicalCenter)(加利福尼亚州洛杉矶(LosAngeles,CA))和近畿大学(KindaiUniversity)(日本大阪(Osaka,Japan))的组织库中收集排出的尿液样品和相关的编码的成像时发现异常或膀胱镜检查时发现异常的受试者中，在麻醉下在手术室进行正式评估。该评估由仅针对膀胱病变的膀胱镜检查或针对上尿路病变的膀胱镜检查和输尿管镜检查试剂盒(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientificInc.,Waltham,MA,USA))分析[0284]使用来自R&D系统公司(R&DSystemsInc.)(明尼苏达州明尼阿波利斯(Minneapolis,MN))的用于Luminex200的本文所述的分析验证的多重基于珠的免疫测定(围的七点标准曲线。在Luminex@100/200(德克萨斯州奥斯汀的路明克斯公司(LuminexCorp,Austin,TX))上读取板。生成校准曲线与结合赤池信息量准则(Akaike's本9.4(北卡罗莱纳州凯瑞的SAS软件研究所(SASInstituteInc.,Cary,NC症群组中的12个癌症群组和41个对照中的19个对照中获得，其中报告的灵敏度为58.3%,[0292]使用约登指数(Youdenindex)截止值和非参数ROC分析来分析10种生物标志物[0293]表9表示使用低级别和高级别以及非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌的