CN119490958A 一种高效诱导调节性b细胞的体系、方法及其应用 （中山大学）

一种高效诱导调节性B细胞的体系、方法及本发明公开了一种高效诱导调节性B细胞的导调节性B细胞的体系，包括基础培养基和诱导明还提供了一种利用所述体系诱导获得调节性B细胞的方法，获得的调节性B细胞主要富集于所述CD19+CD1c+B细胞可以抑制PBMC的增殖，降低效应T细胞炎症因子的释放，用于治疗移植物抗宿主病。本发明有助于调节性B细胞的获得以21.一种用于诱导调节性B细胞的体系，其特征在于，所述体系包括基础培养基和诱导2.根据权利要求1所述体系，其特征在于，所述诱导物为CpG、间充质干细胞和CHIR_4.根据权利要求1或2所述体系，其特征在于，所述基础培养基为RPMI_1640完全培养6.权利要求1或2所述体系在诱导调节性B细胞或在制备用于诱导调节性B细胞的制剂8.一种体外诱导和分选CD19+CD1c+B细胞的方法，其特征在于3[0002]移植物抗宿主病(graft_versus_hostdisease，GVHD)是造血干细胞移植后出现其可以抑制效应T细胞增殖及炎症因子分泌，诱导调节性T细胞(regulatoryTcells，究发现，Bregs与GVHD的疾病发生发展密切相关；造血干细胞移植后与未发病患者相比，GVHD患者外周血Bregs的数量明显降低；缺乏Bregs显著增加小鼠GVHD的严重程度；含有Bregs的脐带血与造血干细胞共同移植能够有效地降低患者GVHD的发生率；GVHD患者治疗后症状改善的同时伴随着Bregs比例的上升。而过继性输注小鼠Bregs可以有效改善小鼠[0007]本发明的第二个目的是提供所述体系在诱导调节性B细胞或在制备用于诱导调节[0010]本发明针对调节性B细胞在外周血中比例较低，难以通过分离获得满足治疗需求4节性B细胞高表达CD1c，且与CD19+CD1c_B细胞相比，CD19+CD1c+B细胞表达更高水平的IL_本发明所述体系诱导获得的CD19+CD1c+B细胞可以抑制PBMC的增殖，降低效应T细胞炎症因用。[0011]本发明提供了一种用于诱导调节性B细胞的体系，所述体系包括基础培养基和诱导物，所述诱导物包括CpG，还包括间充质干细胞(mesenchym经典调节性B细胞CD24+CD27+B细胞相当，但CD19+CD1c+B细胞占CD19+B细胞的比例显著高于在制备用于诱导调节性B细胞的制剂中的应用。诱导培养的CD19+B细胞置于所述体系中诱导培养36～48h，以CD1c为表面标志物分选得到[0025]本发明提供了一种用于诱导调节性B细胞的体系，其可以在促进B细胞表达IL_105[0029]图4为不同诱导体系诱导后分选得到的CD19+CD1c+B细胞和CD19+CD1c_B细胞的IL_[0038]本发明利用不同的诱导体系对分离获得的B细胞进行了诱导培养，并对不同诱导养[0040]采用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。具体地，将外周血与PBS溶液(商品化的6悬液体积比为1:50的比例加入抗人CD19流式抗体；震荡混匀，室温避光孵育30min；每隔[0045]实验组1：CpG诱导组，体系中CpG的终浓度为4μg/mL；所述CpG的序列为：5’_悬至1×106个/mL，实验组1加入CpG使其终浓度为4μg/mL；实验组2分别加入CpG和CHIR_7[0059]本发明利用上述不同的诱导体系对分选到的B细胞进行了诱导培养，同时对不同[0061]本发明利用上述不同的诱导体系对分选到的B细胞进行了诱导培养，同时对不同[0064]本发明对CpG、MSC和CHIR_99021诱导后分选得到的CD19+CD1c+B亚群CD24+CD27+B细胞的IL_10表达能力进行了检测，同时对二者占CD19+B细胞的比例进行8基本相当，但CD24+CD27+B细胞仅占CD19+B细胞的6.32而CD19+CD1c+B细胞占到了CD19+B表达IL_10的能力虽与经典BregsCD24+CD27+B细胞相当，但CD19+CD1c+B细胞占CD19+B细胞[0066]本发明利用传统流式标记对不同诱导体系中诱导后分选得到的CD19+CD1c+B和得到的CD19+CD1c+B细胞表达IL_10的水平显著高于CD19+CD1c_B细胞；即利用CpG、MSC和CHIR_99021诱导后的CD19+CD1c+B细胞的IL_10的表达量显著高于其他作为未刺激组，抗CD3和CD28单抗(CD3/CD28mAb)活化的PBMC为实验组，将分选的CD19+CD1c+B细胞和CD19+CD1c_B细胞分别与CD3CD28mAb刺激能显著促进PBMC增殖，CD19+CD1c+B细胞而非CD19+CD1c_B细胞能显著抑制但CD19+CD1c+B细胞的抑制作用显著强于CD199珠海百试通公司，实验经中山大学实验动物管理与使用委员会的审批(SYSU_IACUC_2022_[0080]使用在免疫缺陷小鼠B_NDG尾静脉输注PBMC的方式构建人