第13篇甾体激素类药物分析课件

甾体激素类药物分析结构·鉴别·检查·含量测定药物分析2026年课程导览01母核结构与分类环戊烷骈多氢菲母核与官能团分析基础02鉴别试验方法呈色反应、官能团反应与光谱色谱鉴别03杂质检查要点其他甾体及特殊杂质检查策略04含量测定方法比色法、紫外法与高效液相色谱法母核结构与分类结构决定性质，性质决定方法环戊烷骈多氢菲母核，是理解本类药物分析方法的起点01甾体激素类药物概述1932—1939年：先后获得雌酮、雌二醇、睾酮及皮质酮的纯品结晶，开创甾体化学与药物化学新领域甾体激素类药物定义甾体激素类药物是指分子结构中含有甾体母核的激素类药物，临床上较为重要来源包括天然物与人工合成品，如氢化可的松、睾酮、雌二醇等母核环戊烷骈多氢菲，由三个六元环（A、B、C环）和一个五元环（D环）稠合而成四大类结构特征对比类别碳原子数A环C17取代基肾上腺皮质激素21Δ⁴-3-酮α-醇酮基雄激素及蛋白同化激素19或18Δ⁴-3-酮β-OH与α-CH₃孕激素21Δ⁴-3-酮甲酮基雌激素18苯环β-OH与α-C≡CH天然皮质激素母核有21个碳原子，雄激素有19个，蛋白同化激素与雌激素为18个；蛋白同化激素在C10上无19-角甲基，如苯丙酸诺龙；雌激素A环为苯环，C3位为酚羟基，结构最为特殊。可供分析的主要官能团识别官能团，就是锁定分析方法的第一步QΔ⁴-3-酮C3酮基和C20酮基：共轭体系，紫外区有特征吸收。C11位酮基或羟基：影响反应速度。C17位官能团：羟基、酮基、甲酮基、α-醇酮基、甲基、乙炔基等，类型最丰富。A环酚羟基：仅雌激素具有，可发生偶合反应。卤素·酯基人工合成品常见，C6或C9上引入卤素，C16引入甲基、羟基。鉴别试验方法官能团各异，鉴别各有其法从硫酸呈色到四氮唑显色，逐一破解官能团鉴别密码02鉴别试验方法总览鉴别是药检工作的首项任务，只有鉴别无误，才能进行后面的检查与测定呈色反应与官能团反应化学鉴别法依据官能团特性，通过显色或沉淀反应快速判真伪显色反应快速判定制备衍生物测熔点专属理化常数将药物制成衍生物后测定熔点，与标准值比对确认熔点测定标准比对光谱法与色谱法光谱法UV、IR，基于特征图谱比对色谱法TLC、HPLC，基于特征图谱比对UV/IRTLC/HPLC与强酸的呈色反应“甾体激素类药物可与硫酸、磷酸、高氯酸、盐酸呈色，荧光反应亦有应用”“灵敏度高，是优点也是挑战”硫酸呈色反应

应用最广操作简便某些药物与硫酸-乙醇或硫酸-甲醇作用呈色，如甲睾酮反应灵敏微量药物即可呈现明显颜色变化操作条件不易掌握呈色受酸浓度、温度、时间等多因素影响C17-α-醇酮基呈色反应C17-α-醇酮基具有还原性，能与以下试液反应呈色适用药物1项肾上腺皮质激素C17-α-醇酮基具有还原性碱性酒石酸铜试液斐林试液呈色反应呈色反应氨制硝酸银试液多伦试液呈色反应呈色反应四氮唑盐最为常用兼作层析显色剂与含量测定呈色反应含量测定酮基与甲酮基的反应C3-酮基和C20-酮基与羰基试剂

2,4-二硝基苯肼、异烟肼、硫酸苯肼

反应生成腙呈黄色，双酮基甾体可生成3,20-双腙C17-甲酮基的呈色反应适用：具有甲酮基的甾体激素类药物（孕激素）能与亚硝基铁氰化钠、间二硝基酚、芳香醛反应呈色黄体酮显蓝紫色，其他甾体呈淡橙色或不显色称为黄体酮专属性反应，即"碱性硝普钠反应"酚羟基与炔基的反应酚羟基的呈色反应偶合反应适用雌激素类药物偶合反应与重氮苯磺酸发生偶合反应，生成红色偶氮染料实例条件以苯甲酸雌二醇为例，反应需酸性条件乙炔基沉淀反应沉淀反应适用含炔基的甾体激素类药物，如炔雌醇、炔诺酮沉淀反应与硝酸银反应生成炔银沉淀，同时释放硝酸滴定可用氢氧化钠滴定，电位法指示终点卤素与水解产物的反应卤素类型破坏方式呈色现象有机氟氧瓶燃烧法与茜素氟蓝-硝酸亚铈呈蓝紫色有机氯氧瓶燃烧法与硝酸-硝酸银生成AgCl沉淀破坏方式选择母核卤素用氧瓶燃烧法破坏，如地塞米松磷酸钠；侧链卤素用加热水解法破坏，如丙酸倍氯他索项目内容适用结构具有醋酸酯、戊酸酯及己酸酯结构的药物流程可先行水解，根据水解产物来鉴别特臭特征戊酸、己酸酯类药物有特臭光谱法与色谱法鉴别“光谱法与色谱法是化学鉴别的重要补充”“化学鉴别与仪器鉴别相互印证，结论更可靠”仪器鉴别方法2类光谱法紫外光谱（UV）与红外光谱（IR）色谱法薄层色谱（TLC）与高效液相色谱（HPLC）衍生化反应测熔点201℃炔雌醇衍生化物熔点238℃黄体酮双肟熔点结构特征与鉴别方法对应甾体药物结构特征与鉴别方法对照结构特征适用药物类别鉴别方法Δ⁴-3-酮多类通用UV、羰基试剂缩合C17-α-醇酮基肾上腺皮质激素还原性反应、四氮唑盐C17-甲酮基孕激素亚硝基铁氰化钠呈色A环酚羟基雌激素重氮苯磺酸盐偶合C17-β-羟基多类通用成酯、酯的水解反应杂质检查要点纯度是药品安全的底线其他甾体、游离磷酸、残留溶剂，逐项把关03其他甾体检查“其他甾体是本类药物的主要特殊杂质。”“由于具有相同甾体母核，杂质理化性质相似，分离难度大。”生产中引入的中间体异构体及未反应完全的原料具有相同甾体母核，杂质理化性质与母体药物相似，分离难度大薄层色谱法（TLC）以醋酸氟轻松中其他甾体检查为例薄层板用硅胶G高效液相色谱法（HPLC）主成分自身对照法面积归一化法特殊杂质检查方法特殊杂质检查体现工艺针对性磷游离磷酸对象地塞米松磷酸钠、氢化可的松磷酸钠来源磷酸酯化时残存的过量磷酸方法钼蓝比色法，在740nm波长处有吸收醇甲醇和丙酮对象地塞米松磷酸钠，生产中使用大量甲醇与丙酮方法气相色谱法测定残留量，甲醇限量为3.1ng酮雌酮对象炔雌醇方法Zimmermann反应，呈紫红色硒硒对象醋酸地塞米松、醋酸氟轻松方法在378nm处测定常规检查与乙炔基检查常规与特殊项目共同构筑纯度控制体系常规检查项目酸碱度检查炽灼残渣检查干燥失重测定残留溶剂检查不溶性微粒检查乙炔基的检查对象：含乙炔基的药物，如炔诺孕酮采用

硝酸银-氢氧化钠滴定法电位滴定法指示终点电极系统：玻璃电极-饱和硝酸钾盐桥-饱和甘汞电极VS含量测定方法准确定量，方知药效几何四氮唑比色法、异烟肼法、UV法与HPLC法各展所长04含量测定方法总览根据甾体激素类药物的官能团和分子结构特征，可选择多种方法进行含量测定方法选择依据：依据官能团和分子结构特征进行含量测定方法的选择根据甾体激素类药物结构特点，可实现准确、专属的定量分析容量法、比色法经典化学分析法适用于原料药及特定制剂化学法经典分析紫外-可见分光光度法、荧光法利用共轭体系特征吸收灵敏度高，操作简便光谱法灵敏度高气相色谱法、高效液相色谱法分离分析，专属选择性好适用于复杂组分测定色谱法专属性强药典常用高效液相色谱法、紫外-可见分光光度法、比色法法定方法HPLC、UV、比色2000年版药典收载品种收载总数97种甾体激素类原料药与制剂法定标准方法收载采用HPLC测定品种HPLC法品种65个占比HPLC为应用最广的色谱方法紫外分光光度法Δ⁴-3-酮吸收240nmΔ⁴-3-酮结构在此波长处有最大吸收苯环（A环酚羟基）吸收280nm苯环（A环酚羟基）在此波长处有最大吸收方法与现状局限方法局限：无专属性，其他甾体对测定有影响，正逐渐被HPLC取代。现状·药典应用现状：中国药典部分药物及制剂仍采用，如炔雌醚、炔孕酮。现状·制剂氢化可的松片、氢化泼尼松片等制剂亦用本法，采用吸收系数法或对照品比较法。四氮唑比色法原理与试剂反应原理皮质激素C17位α-醇酮基（-CO-CH₂OH）具有还原性在强碱性溶液中，将四氮唑盐定量还原为有色甲臜生成的颜色随试剂和条件不同，多为红色或蓝色对C17-α-醇酮基具特异性，药物分解后无此反应，分解产物不干扰常用四氮唑盐试剂试剂简称还原产物λmax氯化三苯四氮唑TTC深红色480~490nm蓝四氮唑BT暗蓝色约525nm反应原理要点四氮唑比色法测定与影响因素反应温度与时间25℃暗处反应40~45分钟测定波长485nm处测吸光度碱性介质常用氢氧化四甲基铵药典测定条件影响因素基团影响：C11-酮基反应快于C11-羟基；C21-羟基酯化后反应减慢溶剂和水分：含水量不超过5%时几乎无影响，30%以上不反应碱的种类与加入顺序：先加四氮唑盐试剂，再加碱试剂空气与光线：产物对光及氧敏感，须避光，英国药典规定充氮气干扰物：聚乙二醇、羊毛脂对BT法有干扰，测油膏须先分离异烟肼比色法应用：

用于倍他米松软膏、哈西奈德软膏、倍他米松磷酸钠及其注射液的测定反应原理甾体激素

C3-酮基

及某些其他位置酮基在

酸性条件

下与异烟肼缩合生成黄色异烟腙，λmax约420nm，比色定量某些具两个酮基的药物可形成

双腙，如黄体酮、可的松、氢化可的松反应条件溶剂仅用

无水乙醇

和

无水甲醇

才能得到满意结果酸与异烟肼试剂摩尔比2:1

时可获得满意吸收度含水量增高，吸收度随之

降低温度升高，反应

加速高效液相色谱法HPLC专属性强，已成为本类药物测定的主流方法优方法优势样品用量少准确、灵敏分离效能好专属性强可分离杂质中间体、异构体及未反应原料等系色谱体系分离模式反相高效液相色谱法固定相ODS（十八烷基硅烷键合硅胶）流动相甲醇-水或乙腈-水检测器紫外检测器，定量方法多为外标法例应用实例醋酸地塞米松原料药、片剂、乳膏均采用HPLC法典型色谱条件药物名称固定相流动相检测波长氢化可的松ODS乙腈-水（28:72）245nm醋酸地塞米松ODS乙腈-水（40:60）240nm黄体酮C8甲醇-乙腈-水（25:35:40）241nm炔诺酮ODS甲醇-水（65:35）244nm雌二醇ODS乙腈-水（55:45）205nm炔雌醇ODS乙腈-水（45:55）280nm不同药物标准色谱条件各异，各实验室须依品种选择匹配的固定相、流动相与检测波长。醋酸可的松含量测定实例